[发明专利]一种促进软骨形成的透明质酸水凝胶的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种促进软骨形成的透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)功能化透明质酸水凝胶的制备：用甲基丙烯酸酯对HA进行改性，得到MeHA，后与光引发剂反应，交联形成水凝胶；(2)采用迈克尔加成反应，接枝RGD多肽和HAV多肽于MeHA；(3)KGN封装PLGA微球的制备：将溶解的PLGA和KGN加入壳聚糖溶液中乳化成球，得到包封KGN的PLGA微球；(4)将包裹KGN的PLGA微球引入接枝RGD和HAV多肽的MeHA体系，交联成胶。本发明还公开了该制备方法所获得的产品及其应用。本发明所述的透明质酸水凝胶通过接枝RGD和HAV多肽，以及引入PLGA‑KGN微球，可以调控三维基质中hMSCs的细胞行为，且可以通过模拟新软骨形成过程中的微细胞环境，依次促进hMSCs的增殖、粘附、凝结、成软骨分化。

技术领域

本发明涉及一种透明质酸水凝胶的制备方法和应用，属于软骨修复或形成领域，特别涉及一种促进软骨形成的透明质酸水凝胶的制备方法和应用。

背景技术

膝关节软骨、颞下颌关节髁突软骨等软骨组织，是创伤、肿瘤、感染、疾病的易发部位，也是人体组织中不可缺少的组成部分。由于软骨缺乏血管以及低细胞性，其自愈能力非常有限，这使得临床治疗极具挑战性。基于合成水凝胶的组织工程为这些问题提供了一个解决方案。透明质酸(HA)、海藻酸钠、壳聚糖等天然材料被用于制备水凝胶。每一种材料都有其优点和缺点，应该根据具体的研究目标来选择。HA常作为软骨修复和再生的支架材料，是软骨、关节腔滑液和各种组织中的细胞外基质(ECM)的重要组成成分。HA水凝胶基质通过提供三维(3D)环境促进细胞的存活和生长，而天然的ECM通过复杂成分和动态三维结构影响细胞。水凝胶基质中，与新软骨形成相关的细胞行为，包括细胞增殖、聚集、分化和基质沉积等行为仍然受限，尤其是在稳定的共价交联水凝胶中。

在软骨形成和基质产生前，间充质干细胞(MSCs)表现为增殖、细胞间广泛接触和凝结。为了模拟MSC微环境，仿生肽被广泛应用于水凝胶中促进细胞活性。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽是整合素结合配体，可将细胞与ECM结合并启动细胞相关信号传导事件。已有报道表明，RGD在水凝胶体系中可以促进细胞的扩散和增殖。此外，RGD肽调控细胞信号传导行为的能力与基质的力学性能、交联程度、弛豫应变等密切相关。Bian等人发现，交联程度较高的MeHA促进了干细胞肥大分化和基质钙化。高交联强度与基质钙化也限制了软骨基质的分泌。Chaudhari等人发现改变凝胶的力学性能和松弛模量可以影响配体的聚集、细胞的扩散和增殖、成骨分化和ECM沉积。此外，在研究HA凝胶的物理性质对软骨细胞的影响时，发现弹性应力调节了软骨细胞的产生和凋亡。这些结果表明，为了实现间充质向软骨分化的最佳效果，应考虑水凝胶基质强度对细胞的影响。

骨髓间充质干细胞的相互作用和凝集是软骨形成所必需的。细胞-细胞相互作用可在粘附过程中触发高神经粘附素(N-cadherin)和神经细胞粘附分子(NCAM)表达，从而促进软骨分化。作为一种跨膜蛋白，来自钙粘蛋白的组氨酸-丙氨酸-缬氨酸(HAV)序列调节细胞与细胞的相互作用。既往研究表明，将HAV多肽接枝到3D电纺丝支架上可促进间充质干细胞的聚集，上调NCAM、N-cadherin和软骨相关基因的表达。在以往的研究中，HAV肽添加到水凝胶体系中已被证明有助于软骨分化。虽然HAV是间充质干细胞软骨分化的良好调节因子，但很少有研究其在3D水凝胶基质中对间充质凝结的作用。为了准确再现软骨再生环境，细胞在水凝胶仿生基质中早期聚集是必要的。

HAV和RGD多肽对hMSCs成软骨分化的调控不能脱离成软骨分化诱导环境。此外，为了更好的在凝胶基质中调控MSCs向软骨分化，将促MSC软骨分化的因子引入三维基质中必不可少。KGN作为一种小分子有机化合物，在促进软骨细胞增殖和hMSCs向软骨分化中具有巨大潜力。与蛋白质生长因子相比，KGN在不同环境下具有良好的物理化学稳定性。但由于KGN的低水溶性和疏水性，无法在MeHA水凝胶等高亲水性水凝胶体系中有效加载。此外，大量的研究表明，生物信号的释放时机对细胞分化的尤为重要。因此，有必要将KGN包载于其他载体，以达到有效和持续的释放趋势。