[发明专利]抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体为利用灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵为抗原免疫产蛋鸡，收集所述产蛋鸡的鸡蛋，并从免疫鸡蛋卵黄中分离和纯化得到。

2.根据权利要求1所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体有包括以下步骤的方法制备得到：

(1)制备抗原：将蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活，作为抗原；

(2)免疫蛋鸡：将灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌与棒状纳米氢氧化铝按照质量比为1：0.5～1.5混合乳化后，首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；其中，棒状纳米氢氧化铝为长径800～1000纳米、短径200～300纳米的棒状氢氧化铝；

(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。

3.根据权利要求2所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，步骤(1)中，将蜜蜂幼虫芽孢杆菌在营养琼脂培养基中扩增培养至菌量1～4×10⁸CFU/mL，离心去上清后,用生理盐水混合得到蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×10⁸CFU/mL的菌悬液，离心，用相同体积的浓度为0.4％的甲醛置换生理盐水，然后灭活，得到灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵抗原。

4.根据权利要求2所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，步骤(3)中，在收集鸡蛋的卵黄液中加入9～10倍体积去离子水稀释，调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体粗提物；对卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。

5.根据权利要求4所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体，其特征在于，向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45～75％，搅拌均匀后，4℃条件下离心，加入PBS溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀后，4℃过夜，在4℃下离心，弃上清液，加入少量PBS溶液重悬，得到卵黄抗体提取液，得到的卵黄抗体提取液用透析袋充分透析，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。

6.权利要求1所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)制备抗原：将蜜蜂幼虫芽孢杆菌灭活，作为抗原；

(2)免疫蛋鸡：将灭活的蜜蜂幼虫芽孢杆菌与棒状纳米氢氧化铝按照质量比为1：0.5～1.5混合乳化后，首次免疫产蛋鸡，再进行第二次、第三次加强免疫，收集鸡蛋；其中，棒状纳米氢氧化铝为长径800～1000纳米、短径200～300纳米的棒状氢氧化铝；

(3)分离纯化卵黄，得到卵黄抗体。

7.根据权利要求6所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，将蜜蜂幼虫芽孢杆菌在营养琼脂培养基中扩增培养至菌量1～4×10⁸CFU/mL，离心去上清后,用生理盐水混合得到蜜蜂幼虫芽孢杆菌菌量为2×10⁸CFU/mL的菌悬液，离心，用相同体积的浓度为0.4％的甲醛置换生理盐水，然后灭活，得到灭活蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵抗原。

8.根据权利要求6所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，在收集鸡蛋的卵黄液中加入9～10倍体积去离子水稀释，调节pH至5.0，于-20℃冰箱中冷冻过夜；解冻后离心收集上清，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体粗提物；对卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。

9.根据权利要求6所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，向卵黄抗体粗提物中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度的45～75％，搅拌均匀后，4℃条件下离心，加入PBS溶液重悬，再次加入饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀后，4℃过夜，在4℃下离心，弃上清液，加入少量PBS溶液重悬，得到卵黄抗体提取液，得到的卵黄抗体提取液用透析袋充分透析，得到抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体。

10.权利要求1所述的抗蜜蜂幼虫芽孢杆菌卵黄抗体在预防和治疗蜜蜂幼虫芽孢杆菌引起疾病方面的应用。