[发明专利]一种青蒿内生菌的分离纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种青蒿内生菌的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采集青蒿的完整植株，清洗，分别取下完整植株的根、茎、叶；

2)分别对步骤1)得到的根、茎、叶进行表面消毒处理；

3)取叶，用无菌水进行研磨，静置，取上清液，涂布在牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，取茎，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，取根，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；

4)将步骤3)得到的牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1～2d，得到的高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d；

5)待各平板上菌落长出，判断菌落的种类，经多次分离、纯化，分别得到纯化的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)所述青蒿的完整植株，为9月份采集的健康、无病虫害的野生青蒿，所述清洗，为用流水冲洗。

3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)所述表面消毒的方法为，分别将根、茎、叶用流水冲洗5h，用滤纸将根、茎、叶表面的水分吸干，经紫外线照射20min后，用75％酒精浸泡2min，然后用无菌水冲洗三次，再用5.4％的NaClO溶液浸泡，其中，根和茎的浸泡时间为10min，叶的浸泡时间为5min，最后用无菌水漂洗三次。

4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)消毒处理后，采用漂洗液检查法和组织印迹检查法进行可靠性检验。

5.根据权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于，所述漂洗液检查法的步骤为：第三次漂洗后的无菌水分别吸取0.1mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1～2d，高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d，无菌落长出证明消毒彻底；所述组织印迹检查法的步骤为：用无菌镊子夹住第三次漂洗完毕的茎和根，使其表面分别与牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板接触5min后取出，牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1-2d，高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d，无菌落长出证明消毒彻底。

6.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤5)得到的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落，分别转移至斜面上，待菌株生长旺盛时取出，置于4℃冰箱保藏备用。

7.一种内生菌的发酵液，其特征在于，包括以下步骤制备得到：

1)取权利要求1-6任一所述分离纯化方法得到的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落，分别经活化，得到青蒿内生细菌、青蒿内生放线菌、青蒿内生真菌；

2)青蒿内生细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入35℃摇床，培养24h，青蒿内生放线菌接入高氏一号液体培养基中，放入28℃摇床，培养5d，青蒿内生真菌接入PDA液体培养基中，放入28℃摇床，培养5d；

3)培养得到的青蒿内生细菌悬液、青蒿内生放线菌悬液、青蒿内生真菌悬液分别移入离心管中，经离心，取上清液，得到内生菌的发酵液。

8.根据权利要求7所述的内生菌的发酵液，其特征在于，步骤3)所述离心，离心参数为12000r/min，离心时间为10min。

9.权利要求7或8所述内生菌的发酵液在用于抑菌中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抑菌，是用于抑制革兰氏阴性大肠埃希菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、黑曲霉和酿酒酵母。