[发明专利]一种斑马鱼血栓模型的制备方法

说明书

本发明涉及一种斑马鱼血栓模型的制备方法，包括以下步骤：1)挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条，移入用胚胎培养水配制的10‑70μmol/L浓度角叉菜胶溶液，置于培养箱内培养24h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；3)将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入DMSO；4)将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；5)用NIS‑ElementsD^TM图像处理软件进行定量分析心脏红细胞染色强度，并计算血栓发生率；本发明的有益效果是：获得了一种斑马鱼血栓模型的制备方法，本发明具有构建方法简便，试剂便宜，成模率稳定的优点。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种斑马鱼血栓模型的制备方法。

背景技术

随着人口老龄化加速，心血管疾病发病率持续升高，由心血管疾病造成的死亡人数远高于肿瘤等其他疾病，居各类疾病死亡率的首位，其中血栓性心血管疾病占据很大比重。

斑马鱼是一种常见的热带鱼，一对斑马鱼一次可产卵200枚左右，卵子体外受精，体外发育，胚胎发育快，胚体透明，可在显微镜下直观观察血管发育情况，且斑马鱼血管与神经系统在分子信号通路上与人和哺乳动物的同源性达到85％以上，是血管新生、血管抑制、血栓疾病等研究的优良模型。

目前，有用花生四烯酸、苯肼、盐酸肾上腺素、激光诱导产生斑马鱼血栓模型，这些方法存在成模率低或试剂毒性强或试剂价格昂贵或仪器昂贵的缺点，因此，有必要寻找一种新的构建斑马鱼血栓模型的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种新的构建斑马鱼血栓模型的方法，其具有构建方法简便，试剂便宜，成模率稳定的优点。角叉菜胶是一种硫酸多糖，可以通过局部血管炎症与内皮细胞的损害引起血栓形成，其机制为炎症损伤血管内皮细胞，在IL-1β作用下，导致炎细胞趋化、浸润，激活外源性凝血系统，造成血栓形成，并在血栓形成后抑制纤溶系统。本发明利用角叉菜胶诱导斑马鱼血栓形成。

本发明的制备过程如下：

1.挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的10-70μmol/L角叉菜胶溶液，置于培养箱内培养24h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；

2.移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；

3.将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入DMSO；

4.将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；

5.用NIS-Elements D^TM图像处理软件进行定量分析心脏红细胞染色强度，并计算血栓发生率；

其中，斑马鱼培养用水配方：5mmol/LNaCl，0.17mmol/LKCl，0.4mmol/L CaCl₂，0.16mmol/LMgSO₄；

其中，邻联茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL邻联茴香胺，0.01mol/L醋酸钠，0.65％H₂O₂，0.16mmol/LMgSO₄。

优选的，本发明动物模型的制备方法，包括以下步骤：