[发明专利]一种副流感病毒5型TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种副流感病毒5型的TaqMan荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，所述试剂盒含有用于检测副流感病毒5型的一对特异性引物和TaqMan探针。本发明的试剂盒检测结果特异性好，PIV5扩增曲线良好，其他兽用病毒生物制品及原辅材料未出现特异性扩增曲线；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，检出限度为10copies/μL；检测快速简便，反转录和PCR在一个反应管进行，减少污染机会；解决了现有PIV5检测方法耗时费力、特异性敏感性差、成本高等的问题，可用于兽用生物制品及原辅材料中PIV5的污染检测，对于PIV5的检测、兽用生物制品质量控制等具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种副流感病毒5型TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

副流感病毒5型(Parainfluenza virus 5，PIV5)为单股负链不分节段的RNA病毒，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)、腮腺炎病毒属(Rubula-virus)，可引起犬、猫、猪、牛、仓鼠、豚鼠等多种动物及人呼吸道感染。PIV5病毒粒子直径为150～200nm，通常呈圆形。PIV5可感染包括人类细胞在内的多种细胞，且在大多数细胞中均可获得高滴度的病毒，其中以非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)更敏感。PIV5对热不稳定，且在酸碱溶液中容易被破坏。病毒有血凝性，能在4℃或25℃的条件下凝集包括豚鼠、犬、家兔、鸡、猪及人O型血红细胞。

PIV5基因组大小为15 246nt，在副黏病毒科病毒中最小，遵循“六碱基原则”，其结构式为3'-NP-V/P-M-F-(SH)-HN-L-5'，其中两侧为3'端非编码区(即前导序列，leadersequence)和5'端非编码区(即尾随序列，trailer sequence)，各基因编码产生蛋白分别为核衣壳蛋白(neucleocapsid protein，NP)、磷酸化蛋白(phosphoprotein，P)、V蛋白(Vprotein，V)、膜基质蛋白(matrix protein，M)、小疏水性蛋白(small hydrophobicprotein，SH)、血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)、聚合酶蛋白(largepolymerase protein，L)。其中NP、P、L三种蛋白为PIV5病毒粒子的重要组成部分，为核衣壳的装配和指导病毒转录复制所必须，相互结合可形成核糖核蛋白体。L蛋白为多功能大蛋白，含有2256个氨基酸，分子量最大，常用副粘病毒科遗传进化分析靶基因或PIV5分子生物学检测靶基因。

2018年，中国兽医药品监察所首次在兽用疫苗中发现PIV5污染，并从疫苗污染样品中分离鉴定出一株牛源副流感病毒5型(PIV5/01株)。随后对近300批次兽用生物制品生产检验用原辅材料以及兽用生物制品进行PIV5污染源头筛选，生产用细胞、牛血清及疫苗中均能检测出PIV5污染，且以细胞和牛血清中检出的污染批次最为突出，同时在某厂家使用的PK15细胞中分离鉴定出一株猪源副流感病毒5型(PIV5/02株)，由此推测目前造成我国兽用生物制品PIV5污染的主要源头可能为细胞和牛血清。

PIV5的检测方法有病原学方法(病毒分离与鉴定、分子生物学检测方法和血凝试验等)和血清学方法(包括免疫荧光试验、中和试验、血凝抑制试验、酶联免疫吸附实验等)。但大都存在不足，如电镜检测复杂昂贵，病毒分离培养耗时费力，血清学方法易出现假阳性；常规RT-PCR扩增只可对特定基因进行扩增，但不能进行定量分析。而荧光定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基因，对未知模板进行定量分析。一步法荧光定量RT-PCR技术能准确检测出样品中病毒的基因数目，具有特异性强、灵敏度高的优点；反转录和PCR在一个反应管进行，可在较短时间内得到结果，有效解决普通PCR污染问题。

发明内容

本发明的目的是为克服现有PIV5检测方法耗时费力、特异性敏感性差、成本高等缺点，提供了一种特异、敏感、快速、简便、可定量检测PIV5的一步法荧光定量RT-PCR检测试剂盒，应用于PIV5的检测和兽用生物制品的质量控制。