[发明专利]CYP1B1基因缺失斑马鱼的制备

权利要求书

1.CYP1B1基因缺失斑马鱼的制备，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据CYP1B1基因序列，确定CYP1B1靶位点；

2)根据CYP1B1靶位点，设计Oligo序列；

3)构建gRNA体外转录载体；

4)PCR获得gRNA体外转录模板；

5)对步骤4获得的模板进行体外转录，得到gRNA；

6)制备Cas9 mRNA的体外转录模板；

7)体外转录Cas9 mRNA；

8)添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；

9)将Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；

10)将F₀胚胎饲养至性成熟；

11)与野生型成鱼外交，筛选F₀；

12)选取可产生有效突变的F₀自交，筛选F₁；

13)从F₁代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F₂代；

14)筛选CYP1B1基因敲除纯合子即为稳定遗传的CYP1B1基因缺失斑马鱼。

2.如权利要求1所述的CYP1B1基因缺失斑马鱼的应用，所述的CYP1B1基因缺失斑马鱼用于结肠癌、胃癌、食管癌病的研究。