[发明专利]基于球形核酸的级联信号放大高灵敏检测外泌体

说明书

由于外泌体与生理、病理过程的改变有紧密的联系，因而，外泌体被视为一种很有前景的生物标志物。当前，高灵敏检测外泌体依然是一个巨大的挑战。我们提出了基于球形核酸(spherical nucleic acids，SNAs)级联信号放大策略用于高灵敏检测外泌体。在该方法中，引物链通过疏水作用力与外泌体膜结合形成SNAs。接着，SNAs可被脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)聚合形成polyT链。polyT链作为模板在核酸外切酶III(Exo III)作用下不断切割信号探针(探针A)。随后，新的引物链和新的模板链不断生成，并在双酶的作用下消耗探针A，最后导致电化学信号剧烈降低。总之，该方法提供了一种简单的基于SNAs的级联信号放大策略用于高灵敏检测外泌体并具有潜在的临床诊断应用价值。

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及基于球形核酸和酶介导的信号级联放大检测外泌体的原理，过程，实验条件及应用。

发明背景

外泌体是一个装载有蛋白、核酸以及小分子代谢物的膜结构复合体，其内容物组成及变化往往与组织细胞的生理状态密切相关。肿瘤的发生、发展与转移也影响外泌体上膜蛋白、膜内核酸变化。各种不同的细胞均能分泌外泌体并释放到体液中，在全身循环。血液、尿液、唾液中均能发现外泌体的存在。外泌体作为液体活检中一种有巨大潜力的肿瘤标志物，在疾病诊断、治疗预后方面有重要的临床价值。因此，准确、灵敏检测外泌体对于进一步研究外泌体的功能以及临床诊断具有重要意义。

由于外泌体在疾病诊断和预后中的重要作用，研究人员设计了许多方法用于外泌体的检测分析，比如传统的酶联免疫吸附(ELISA)、免疫印迹 (western blotting)和纳米粒子示踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)。但这些方法一方面操作较为繁琐，需要熟练的技术；另一方面所需的样品量较大，且检测的灵敏度较低。因此发展新的方法用于外泌体简单、灵敏的检测有利于促进外泌体的深入研究与临床应用。当前，利用表面增强拉曼光谱、流式细胞术、微流控、电化学等方法能够对外泌体进行较为灵敏的检测分析。这些方法通常利用抗体或者适体作为特异性检测探针与外泌体膜蛋白结合后用于信号放大。抗体价格较为昂贵且不稳定，需要放于-20℃低温中保存；适体通常需要比较复杂的设计以降低背景信号或者响应靶标发生构象变化。这些方法中使用的抗体和适体可能增大外泌体检测分析的成本和设计难度。为此，设计出一种比较通用型的高灵敏检测外泌体的方法仍然具有挑战。

球形核酸(Spherical nucleic acids，SNAs)是一种修饰在球形纳米材料上的一层致密和高度定向的核酸。由于与互补核酸或者受体蛋白结合的亲和力强，球形核酸越来越多地被用于生物监测和药物递送。外泌体是一种由磷脂双分子层组成的球形或类球形囊泡，能够与修饰胆固醇的分子通过疏水作用结合。受此启发，外泌体能够作为一个核心模板大量结合修饰胆固醇的核酸链以形成球形核酸。因此，我们对于外泌体的检测可以转换成对膜蛋白和膜脂的检测。即利用膜蛋白适体特异性捕获外泌体，接着疏水的磷脂双分子层与修饰胆固醇的 DNA单链基于疏水作用力结合形成球形核酸，结合上外泌体的球形核酸则引发信号放大反应。由此，我们提出了一个外泌体膜上核酸结合、生长、切割的循环信号放大方法用于高灵敏检测外泌体。

发明内容

本发明的目的是基于球形核酸的级联信号放大用于高灵敏检测外泌体。