[发明专利]一种tTIM融合蛋白疫苗、制备方法及应用

权利要求书

1.一种tTIM融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述tTIM融合蛋白疫苗的制备方法包括：

在线网站获取TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列；

通过软件Propred.MHC Class-II Binding Peptide Prediction Server预测OVA的主要T细胞表位AI-15、VE-15、GI-15、IC-15；

利用过敏性哮喘小鼠的血清和小鼠抗OVAIgG为一抗，通过Western Blot和ELISA筛选出OVA优势T细胞表位IC-15；

以linker将TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列与筛选出的OVA主要抗原表位IC-15短肽基因序列进行连接，合成TAT-T-bet-IC-15-MHC-II融合基因，同时合成无携带TAT48-60的T-bet-IC-15-MHC-II融合基因；

将tTIM融合基因克隆到pET-32a表达载体上并转化入大肠埃希菌工程菌中；

大肠埃希菌BL21经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导培养，表达tTIM融合蛋白；

通过6His-tag蛋白纯化系统纯化tTIM融合蛋白，确定tTIM融合蛋白疫苗制备的最佳工艺条件。

2.如权利要求1所述的tTIM融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述TAT48-60的基因序列为GRKKRRQRRRPPQQ。

3.如权利要求1所述的tTIM融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述T-bet的GeneID为57765，所述MHC-II的GenBank ID为111364。

4.如权利要求1所述的tTIM融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述T细胞表位AI-15的基因序列为AMVYLGAKDSTRTQI，所述VE-15的基因序列为VVRFDKLPGFGDSIE，所述GI-15的基因序列为GLFRVASMASEKMKI，所述IC-15的基因序列为IKHIATNAVLFFGRC。

5.如权利要求1所述的tTIM融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述小鼠抗OVAIgG多克隆抗体的制备方法，包括：

(1)通过南京的GenScript公司合成T细胞表位肽；

(2)制备小鼠抗OVAIgG多克隆抗体，对生产的抗体进行OVA特异性鉴定。

6.如权利要求5所述的tTIM融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述对生产的抗体进行OVA特异性鉴定的方法，包括：

1)ELISA微孔板用20μg/ml的OVA包被，加进抗OVA多克隆抗体孵育；微孔用BSA包被，作为非特异性对照抗原，统计检验方法为ANOVA；

2)用抗OVA的多克隆抗体包被ELISA微孔板，加梯度浓度的OVA-T细胞表位肽，按照ELISA的测试程序操作，统计检验方法为ANOVA。

7.一种应用如权利要求1～6任意一项所述的tTIM融合蛋白疫苗的制备方法制备得到的tTIM融合蛋白疫苗。

8.一种如权利要求7所述的tTIM融合蛋白疫苗在制备缓解过敏性疾病临床症状的药物中的应用。