[发明专利]海藻酸钠亲和层析介质的制备方法及在玻璃酸酶提取中的应用

说明书

本发明公开了海藻酸钠亲和层析介质的制备方法，包括以CNBr活化的琼脂糖凝胶与己二胺反应生成原料的步骤；以及将原料与羧甲基纤维素、海藻酸钠共混相容生成海藻酸钠亲和层析介质的步骤，本发明人经大量实验，以上述步骤合成了含海藻酸钠的亲和层析介质，并应用在玻璃酸酶的提取中，发现有助提取高效价玻璃酸酶，达到2000u/m l以上。

技术领域

本发明涉及玻璃酸梅提取技术领域，具体涉及海藻酸钠亲和层析介质的制备方法，以及制备的海藻酸亲和层析介质在玻璃酸酶提取中的应用。

背景技术

玻璃酸酶系从哺乳动物睾丸中提取的一种能水解玻璃黏多糖的酶，又称透明质酸酶，是一种碱性糖蛋白，属内切糖苷酶，能催化玻璃酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C的β-N-乙酰氨基己糖糖苷键水解。它在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子，也存在于精子、颌下腺、蜂毒、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。临床用于局部注射，可加速皮下、肌内注射药液的吸收，促进局麻药的浸润，促进手术及创伤后局部水肿或血肿的扩散，也用于肠粘连。

此外，玻璃酸酶还可用于肿瘤治疗可以降低人膀胱癌的复发率；用于心肌梗塞治疗可使心肌透明质酸含量显著降低，增加血流量；另外用玻璃酸酶的酶液滴注眼前房可以降低白内障病人术后过高的眼内压。玻璃酸酶不但在医药领域有着广泛的应用，而且在保健品领域也有卓越的贡献，人为补充玻璃酸酶可消除皱纹或使局部器官增厚增高，使皮肤保持弹性，从而达到整容效果。

较知名的透明质酸酶产品不多，以Amphadase、Hyase、Vitrase、Wydase、Hylenex为例，其中Hyase、Vitrase、Wydase已停产，其中Amphadase和Hyase提取自牛睾丸，Vitrase为羊睾丸来源的透明质酸酶，不含防腐剂，其中Hylenex为从仓鼠卵巢细胞表达的重组人员透明质酸酶，酶活达到200U/ml，其余产品为150U/ml，其酶活已不能满足需求，对此市面上不断有企业进行相关的研究，如常规的提取法、发酵法及基因工程法，其中根据报道提取法、发酵法的酶活普遍在1500U/ml以下，不能满足需求,如专利文献1中公开玻璃酸酶提取方法，其成品效价在1500u/ml，专利文献2中公开玻璃酸酶提取方法，其成品效价在300iu/ml，而基因工程法的技术难度高，如Berry等公开将重组肺炎菌基因在大肠杆菌内表达最终得到极高效价的玻璃酸酶，但目前并无量产的可能，而部分研究人员在采用重组化脓链球菌基因在大肠杆菌胞内表达，但得到的玻璃酸酶效价极低，可见基因工程尚处于探索阶段，并不能实际应用，对此需对提取法或发酵法进一步研究，以寻求改进。

专利文献1：牛或羊玻璃酸酶生产工艺，申请公布号：CN103103170A。

专利文献2：一种提取玻璃酸酶精品的方法，授权公告号：CN13740667B。

发明内容

为解决上述技术缺陷，本发明提供了如下技术方案：

本申请文件第一方面提供海藻酸钠亲和层析介质的制备方法，

包括以CNBr活化的琼脂糖凝胶与己二胺反应生成原料的步骤；

以及将原料与羧甲基纤维素、海藻酸钠共混相容生成海藻酸钠亲和层析介质的步骤。

本发明人经大量实验，以上述步骤制成了含海藻酸钠的亲和层析介质，并发现其在玻璃酸酶提取中功效明显，有助制取高效价玻璃酸酶。

进一步，原料的生成：以CNBr与琼脂糖凝胶在碱性条件下与己二胺反应，时间15-30h，之后将反应产物洗至中性。

如在一实施例中，以GE Health CNBr活化Sepharose 4B凝胶，之后在pH9.0碱性条件下与1,6-二氨基己烷反应，如15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、24h、26h、28h、30h等，在其他实施例中，碱性条件pH也可根据需求进行调整，如8.5、9.5等，或对CNBr，或琼脂糖凝胶的厂家、型号进行调整。