[发明专利]一种三叶青试管苗离体保存的方法

权利要求书

1.一种三叶青试管苗离体保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取三叶青茎尖作为外植体，在质量浓度75％酒精中浸泡，无菌水冲洗，滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗，再滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗，剪成0.5-1.0cm长接种在第一培养基中，培养，所述第一培养基包括500-650mg/L NH₄NO₃、600-700mg/L KNO₃、100-150mg/L MgSO₄·7H₂O、60-100mg/L KH₂PO₄、0.1mg/L BA、20-25g/L蔗糖、5-10g/L琼脂，在第一培养基的培养温度20±2℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间16h/d，每280-300d继代1次；

(2)在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小1-3mm的离体茎尖为材料，将离体茎尖置入第二培养基，培养，所述第二培养基为含0.3-0.5mg/L蔗糖的MS固体培养基，所述第二培养基的培养温度为25±2℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为16h/d；

(3)将在第二培养基中培养后的无菌苗置于25g/L海藻酸钠+2mol/L甘油+0.8mol/L蔗糖的无钙MS培养液中， 用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙MS培养液滴至含0.1mol/L氯化钙+2mol/L甘油+0.8mol/L蔗糖的培养液中， 并于25℃保持2-30min使之成包埋球；

(4)将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上， 在无菌空气流中干燥1-2h；

(5)无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装10-20个包埋球；

(6)将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架或沙袋后投入液氮进行超低温保存。

2.根据权利要求1所述的一种三叶青试管苗离体保存的方法，其特征在于，步骤(3)中每个包埋球大小4-5mm，含有一个茎尖。

3.根据权利要求1所述的一种三叶青试管苗离体保存的方法，其特征在于，步骤(6)所述超低温保存为在-196℃进行保存。