[发明专利]一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法

权利要求书

1.一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)通过三维软件模拟颌骨组织微结构，得到仿生薄层皮质骨支架模型和松质骨支架模型；

2)用生理盐水溶解GelMA，随后依次将光引发剂和BMP-2均匀溶解于GelMA溶液中，调节溶液的pH至中性，分别得到皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液；

3)将步骤2)得到的皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液分别通过光固化分层打印步骤1)中的皮质骨支架模型和松质骨支架模型，洗净打印过程中未交联固化的GelMA，分别得到具有中空脉管网络流道的皮质骨预备支架和疏松多孔道的海绵状松质骨预备支架；

4)将步骤3)得到的皮质骨预备支架和松质骨预备支架置于超低温环境下，使预备支架内部的水分子快速形成冰晶；随后置于低温环境下回火，使冰晶融合生长并形成连通的微结构；最后梯度升温，真空干燥以去除水分，灭菌后得到皮质骨支架和松质骨支架；

5)将目标自体牙髓间充质干细胞分别培养于成骨诱导培养基和成血管诱导培养基中，诱导7～14天以使目标自体牙髓间充质干细胞向成骨及成血管的分化，消化重悬后得到成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC；

6)将步骤5)得到的成血管化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的中空脉管网络流道内，将成骨化诱导的hDPSC接种于皮质骨支架的上表面和下表面，培养以使细胞遍布于整个皮质骨支架，得到功能化皮质骨支架；将成骨化诱导的hDPSC和成血管化诱导的hDPSC混合后接种于松质骨支架上，培养以使细胞遍布于整个松质骨支架，得到功能化松质骨支架；

7)通过电流体力学印刷技术，利用聚己内酯打印形成网状支架结构；用生理盐水将GelMA溶解，随后加入光引发剂，得到软组织层预聚液；将所述网状支架结构置于预聚溶液中，通过光固化使其成形，灭菌后得到软组织支架；

8)用生理盐水在无菌条件下溶解GelMA，随后加入光引发剂，得到预聚成型液；将软组织支架、功能化皮质骨支架和功能化松质骨支架按照从上到下的顺序依次叠合，并于叠合界面处均匀滴加所述预聚成型液，光固化以使三者一体化成形，得到超仿生软硬组织复合支架。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述皮质骨GelMA预聚液中GelMA的取代率为90％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％，BMP-2的浓度为600～800ng/mL；所述松质骨GelMA预聚液中GelMA的取代率为60％，质量浓度为10％，光引发剂的质量浓度为0.5％，BMP-2的浓度为200～400ng/L。

3.根据权利要求1或2任一所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中三维软件为SolidWorks软件；步骤2)中将溶液的pH调节为7.4；所述灭菌采用Co60辐照24小时。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中通过DLP光固化3D打印机实现皮质骨GelMA预聚液和松质骨GelMA预聚液的光固化分层打印，并在摇床中通过含有等渗BMP-2的生理盐水溶液将打印出的皮质骨预备支架和松质骨预备支架中未交联固化的GelMA洗净，并将未被交联的剩余光引发剂浸出。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，将所述皮质骨预备支架和松质骨预备支架置于-80℃ 的冰箱中快速降温，并保持3小时，使预备支架内部的水分子快速形成冰晶；随后置于-20℃ 的冰箱中回火5小时，使冰晶融合生长并形成连通的微结构；最后置于冻干机中梯度升温，真空干燥24小时以去除水分，灭菌后得到皮质骨支架和松质骨支架。