[发明专利]BnaSVP基因在调控油菜花期中的应用、具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法

权利要求书

1.具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，其特征在于：克隆BnaSVP的基因组序列，利用CRISPR/CAS9技术靶向BnaSVP的四个同源拷贝，获得突变体，所述突变体材料由所述的BnaSVP的同源拷贝中BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变所产生的基因编码区内的核苷酸序列突变获得；

其中，所述BnaSVP基因的四个拷贝的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.1所示的BnaA09.SVP，SEQ ID NO.2所示的BnaA04.SVP，SEQ ID NO.3所示的BnaC08.SVP，SEQ IDNO.4所示的BnaC04.SVP;

所述BnaA09.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.5，所述BnaA04.SVP的氨基酸序列见SEQID NO.6，所述BnaC08.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.7，所述BnaC04.SVP的氨基酸序列见SEQ ID NO.8。

2.根据权利要求1所述的具有不同开花期的油菜突变体材料的制备方法，其特征在于：

所获突变体单株为：BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2 、BnaSVP29-3 aa1aa2CC1cc2 、BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2 、BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2 、BnaSVP38-5 AA1aa2CC1cc2 、BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2。

3.获取如权利要求2中所述的突变体单株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获取BnaSVP基因片段；

步骤2：针对BnaSVP基因的核苷酸序列设计sgRNA，并构建载体；

步骤3：将步骤2中构建的载体转化至油菜株系中，获得突变体油菜株系；

步骤4：对突变体油菜株系进行检测并测序，确定株系基因型；

步骤5：获得的突变体油菜株系种植并自交分离，获得BnaA09.SVP的单拷贝突变，BnaA09.SVP和BnaC04.SVP两个拷贝同时突变，BnaA09.SVP和BnaC08.SVP两个拷贝同时突变，BnaA04.SVP、BnaA09.SVP和BnaC08.SVP三个拷贝同时突变，及BnaSVP的四个拷贝同时突变的突变体材料；

步骤2中设计四个sgRNA，其中S1，S2，S3靶向BnaA04.SVP拷贝，S1，S2，S4靶向BnaA09.SVP，BnaC04.SVP和BnaC08.SVP拷贝。

4.根据权利要求3所述的获取突变体单株的方法，其特征在于，获得的纯合突变体的sgRNA序列为：

BnaSVP17-5 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGGA----CAAGG -4bp

S2

CCGTTC--TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT +A

c1-1 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT +2bp

c1-2 CCGTTC------CGACGCTGATGTT -4bp

c2-1 CCGTTCT-TCTGCGACGCTGATGTT +T

c2-2 CCGTTC---CTGCGACGCTGATGTT -T

BnaSVP29-3 aa1aa2CC1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGAACTTCAAGG wt

a1 ATGAGAGGAGAGG------AAGG -6bp

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T

c2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T/58%

c2-2 CCGTTC-T—GCGACGCTGATGTT -2bp/42%

S4

CGAGAGAGAAGATTCAG-ATCAGG wt

a2 CGAGAGAGAAGATTCAGTATCAGG +T

c2 /--------------------AGG -31bp

BnaSVP52-11 aa1aa2cc1cc2

S1

ATGAGAGGAGAGGGAACTTCAAGG wt

a1-1 ATGAGAGGAGAGGGAAC-TCAAGG -T/60%

a1-2 ATGAGAGGAGAGGGAAC----AGG -4bp/40%

a2 ATGAGAGGAGAGGG-----CAAGG -5bp

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTACTGCGACGCTGATGTT +2bp/74%

a2-2 CCGTTCT---TGCGACGCTGATGTT -C/10%

c1-1 CCGTTCTA-CTGCGACGCTGATGTT +A/45%

c1-2 CCGTT------GCGACGCTGATGTT -4bp/55%

c2 CCGTTCT-------ACGCTGATGTT -5bp

BnaSVP48-3 AA1aa2cc1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2 CCGTT----TGCGACGCTGATGTT -3bp

c1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T

S4

CGAGAGAGAAGATTCAGATCAGG wt

c1 CGAGAGAGAAGAT-----TCAGG -5bp

BnaSVP38-5 AA1aa2CC1cc2

S2

CCGTTCT--CTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTA---GCGACGCTGATGTT +A/60%

a2-2 CCGTTCT----GCGACGCTGATGTT -2bp/40%

c2 CCGTTCTATCTGCGACGCTGATGTT +2bp

BnaSVP25-8 AA1aa2CC1CC2

S2

CCGTTC-TCTGCGACGCTGATGTT wt

a2-1 CCGTTCTTCTGCGACGCTGATGTT +T/43%

a2-2 CCG--------------------/ -28bp/57%。