[发明专利]大肠杆菌偏嗜性可溶性猪PD-1重组蛋白的制备及应用

说明书

本发明涉及一种大肠杆菌偏嗜性可溶性猪PD‑1重组蛋白的制备及应用，其中可溶性猪PD‑1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，利用基因克隆技术得到经过密码子偏嗜性修饰的猪PD‑1基因的可溶性重组蛋白，该可溶性猪PD‑1重组蛋白能有效提高PCV2疫苗免疫后PCV2的抗体水平以及机体免疫力，增强猪对PCV2疫苗的免疫应答，提高接种动物的免疫力，可解决现有技术PCV2疫苗免疫后效果不理想的问题。

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌偏嗜性可溶性猪PD-1重组蛋白的制备及应用，属于生物医药领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)病是目前危害世界养猪业的重要疫病之一，PCV2的致病力与毒株类型直接相关。PCV2分型的依据是ORF2的序列差异。PCV2主要包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e在内的五个亚型，其中PCV2b是当前主要流行的基因型。当前国内呈现不同基因亚型同时流行的新形势，PCV2a和PCV2b混合感染增多，PCV2d也出现感染增多并且成为感染的主要亚型。在中国，PCV2流行毒株中PCV2b毒株的毒力显著高于PCV2a，这也可能是猪圆环病毒病产生严重危害的重要原因。因此，需要研究新的疫苗或疫苗佐剂，用于PCV2的预防。

PCV2感染后造成机体的免疫抑制，形成严重的经济损失。目前，猪PCV2感染后T细胞免疫抑制性受体及其调节机制的研究还不清楚。PCV2感染使CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞数量减少，造成免疫抑制和免疫损伤。PCV2和/或共同感染病原体的宿主免疫调节被认为是临床疾病发展的关键。混合感染猪瘟病毒与猪繁殖与呼吸综合征病毒或者单独感染猪流感病毒，能够导致猪T细胞表面抑制性受体细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CytotoxicTlymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4，又称CD152)、程序性细胞死亡因子1(Programmed death 1，PD-1，又称CD279)的表达量上升。自然感染PCV2时，PD-L1和它的配体PD-L2的表达量均上升，PD-1/PD-L1通路激活发挥免疫负调节作用，在造成机体免疫抑制发挥着重要作用。用抗PD-1/PD-L1的抗体或可溶性PD-1蛋白阻断抑制受体与其相关配体之间的相互作用，可以逆转T细胞衰竭，增强细胞介导的免疫反应。

因此，本发明旨在制备可溶性猪PD-1重组蛋白阻断PCV2感染时免疫抑制受体PD-1与配体对相关细胞因子的转录变化的影响，评价可溶性猪PD-1重组蛋白对PCV2产生的免疫抑制的调节作用，增强机体的免疫反应，为PCV2新型疫苗增强剂或佐剂的研制奠定基础，也为PCV2的防治提供新策略。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种大肠杆菌偏嗜性可溶性猪PD-1重组蛋白的制备及其在PCV2疫苗中的应用，旨在提高PCV2疫苗免疫后PCV2抗体水平以及机体免疫力，解决现有技术PCV2疫苗免疫后效果不理想的问题。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种可溶性猪PD-1重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码可溶性猪PD-1重组蛋白的DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的可溶性猪PD-1重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求2所述的DNA分子克隆入表达质粒pET-32a(+)中，获得重组表达载体pET-32a-PD1；

(2)将步骤(1)获得的重组表达载体pET-32a-PD1转化至大肠杆菌Rosetta工程菌株中，挑取单菌落于37℃培养作为种子液；

(3)将步骤(2)获得的种子液按体积比1:100接种于含Amp的YT培养液中，37℃培养至OD₆₀₀值为0.5～1.0，加入IPTG，进行诱导培养；