[发明专利]新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒N蛋白含量的检测方法

说明书

本发明提供新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒N蛋白含量的检测方法。该检测方法利用了本发明的定量肽段(AYNVTQAFGR)；定量肽段的定量离子对中母离子质荷比为563.7853，子离子质荷比为679.3520和/或892.4640。利用该定量肽段和定量离子对，通过高效液相色谱串联质谱定量检测方法，N蛋白标准品制作标准曲线，将待测新冠病毒疫苗孵育酶解后进行定量检测，得到样品中定量肽段的子离子峰面积，进而计算得到样品中新型冠状病毒N蛋白的含量。该方法检测准确率高，精确度高，避免了疫苗样品中基质效应等对检测的影响，能够用于新冠病毒灭活疫苗各阶段中间产品及成品的新冠病毒N蛋白含量检测。

技术领域

本发明属于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)灭活疫苗检测技术领域，涉及新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒N蛋白含量的检测方法，尤其涉及利用液相色谱串联质谱定量检测新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒N蛋白含量的方法。

背景技术

SARS-CoV-2病毒直径在为60～140nm，主要有4种结构蛋白，分别为S(棘突) 蛋白、N(核衣壳)蛋白、M(膜)蛋白、E(包膜)蛋白。其中，SARS-CoV-2核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)位于病毒内部，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，在病毒体组装过程中，N蛋白与病毒RNA结合并导致螺旋核衣壳的形成。N蛋白含有大量的抗原决定簇，可以产生针对病毒的保护性抗体。研究表明新冠病毒感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。此外，SARS-CoV-2的核衣壳蛋白有可能诱导特异性T细胞免疫反应，对拮抗病毒感染也具有重要作用。

灭活疫苗是针对新发突发传染病最有效的疫苗研发途径。具有生产工艺成熟、质量标准可控、保护范围广等优点，可用于大规模接种，并且有国际通行标准来判断疫苗的安全性和有效性。灭活疫苗中有效抗原含量的检测，如新冠病毒中S蛋白和N 蛋白的含量测定，对于疫苗评价有着十分重要的意义。

传统方法检测灭活疫苗中新型冠状病毒N蛋白含量需要依靠免疫学分析方法，如双抗体夹心酶联免疫法检测。

采用酶联免疫技术检测新型冠状病毒中的N蛋白，利用重组N蛋白免疫动物制备特异性单克隆或多克隆抗体，建立双抗体夹心法，将特异性N蛋白抗体包被酶标板，加入待测样品孵育后，加入标记辣根过氧化物酶的N蛋白抗体进行检测，通过标准曲线可以定量检测待测产品中SARS-CoV-2的N蛋白含量。酶联法检测N蛋白的技术中，制备特异性N蛋白抗体十分关键，然而，抗体制备过程比较耗时，无法在短时间内建立高灵敏度的特异性检测方法。酶联免疫技术由于其自身局限性，其在检测过程中易受环境因素影响，故其稳定性和重复性较差。此外酶联免疫法线性范围较窄，一般为10²，对于未知浓度样品需要进行预实验或样品稀释，才能将样品落在最佳线性范围内得到准确测定。

近年来，液相色谱串联质谱技术在蛋白质的检测分析方面具有高选择性和高灵敏度等优点，非常适用于复杂生物基质中靶向蛋白质的定性和定量研究。

发明内容

基于现有技术检测新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒N蛋白的缺陷，本发明的第一目的在于提供一种用于液相色谱串联质谱定量检测新型冠状病毒N蛋白的定量肽段；本发明的第二目的在于提供所述定量肽段在液相色谱串联质谱定量检测新型冠状病毒N蛋白中的应用；本发明的第三目的在于提供一种新型冠状病毒灭活疫苗中新型冠状病毒N蛋白含量的检测方法，其利用本发明筛选获得的新型冠状病毒的N蛋白定量检测的定量肽段和定量离子对，通过高效液相色谱串联质谱定量检测方法，利用N蛋白标准品制作标准曲线，将待测新冠疫苗中间产品及成品经样品处理和酶解后进行高效液相色谱串联质谱定量检测，得到样品中定量肽段的MRM峰面积(即：子离子峰面积)，基于标准曲线和进样体积获得待测的灭活疫苗样品中新型冠状病毒SARS-CoV-2的定量肽段的含量，除以进样体积，即得到待测的灭活疫苗样品中新型冠状病毒N蛋白的浓度。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：