[发明专利]一种植物腈水解酶嵌合酶突变体、编码基因及其应用

说明书

本分案申请公开了一种十字花科植物腈水解酶嵌合酶突变体，属于生物工程技术领域。本发明将高山南芥腈水解酶氨基酸序列的225‑285位肽段嵌入到缺失对应肽段的芜菁腈水解酶中，获得芜菁/高山南芥腈水解酶嵌合体BaNIT，进而对嵌合体BaNIT的编码基因进行定点饱和突变，使得嵌合体氨基酸序列的第223位的L突变为Q，获得植物腈水解酶嵌合酶突变体BaNIT‑L223Q。本发明提供的植物腈水解酶嵌合酶突变体的催化活力提高1.31倍，重组蛋白的可溶性提高，对映体选择率E值保持在400以上，在高效催化外消旋异丁基丁二腈合成(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸中具有良好的应用前景。

本申请为申请号201810765047.5、申请日2018年7月12日、发明名称“一种植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种十字花科植物腈水解酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋异丁基丁二腈制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

背景技术

腈类化合物是有机合成的重要中间体，可以合成酰胺、羧酸、氧肟酸等附加值更高、应用范围更广的化学品，广泛应用于化工、农药和医药等工业领域。但腈的化学水解往往需要强酸(或强碱)、高温、高压等反应条件，环境污染严重。腈水解酶生物催化具有高度的化学、区域及立体选择性，且反应条件温和、环境污染小，符合绿色可持续发展的要求，在有机化工领域具有广阔的应用前景。目前腈水解酶已成功应用于烟酸、(R)-扁桃酸和1,5-二甲基-2-哌啶酮等精细和医药化学品的工业化生产。

随着现代分子生物学技术的发展以及工业生产环境对生物催化剂的需求，蛋白质分子改造已成为当前酶工程研究的热点。分子改造技术在腈水解酶催化活力、底物特异性、热稳定性和立体选择性等应用属性的改造中发挥了重要作用。

Schreiner等对Alcaligenes faecalis腈水解酶进行分子改造，获得了一株可以高效催化(R)-2-氯-扁桃腈水解合成(R)-2-氯-扁桃酸的突变体(Enzyme Microb.Tech.,2010,47,140-146)。DeSantis等利用DNA改组技术改造腈水解酶，分别获得能够催化3-羟基戊二腈合成S-型和R-型产物的腈水解酶突变体，ee值大于95％，产率达到98％(J.Am.Chem.Soc.,2003,125,11476-11477)。

外源基因在大肠杆菌表达的一个挑战是目的蛋白常形成无活性的包涵体，严重影响酶的催化性能。分子改造技术可通过替换某个或某几个氨基酸，减少包涵体的形成，提高蛋白的可溶性表达。Xie等人通过对Lov D氨基酸序列半胱氨酸残基的替换，成功构建催化活力和蛋白可溶性表达均提高50％的双突变体C40A/C60N(Biotechnol.Bioeng.,2009,102,20-28)。

普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB)，化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的3位异丁基取代物(Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47,3500-3504)，是治疗脊髓损伤、焦虑以及癫痫等疾病的主要药物。腈水解酶区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈(IBSN)合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)路线具有原料廉价、工艺简单、原子经济性高等显著优势。但目前已报道的腈水解酶催化活力及立体选择性低，不能满足工业化生产需求。因此，开发能够高效拆分IBSN的新型、高效腈水解酶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可溶性和催化活性均提高的十字花科植物腈水解酶突变体，满足工业化生产的要求。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：