[发明专利]病原微生物耐药基因归属模型及其建立方法和应用

说明书

本发明涉及一种病原微生物耐药基因归属模型及其建立方法和应用，属于基因检测技术领域。该方法包括以下步骤：建立病原微生物基因数据库和耐药基因数据库；获取临床样本的病原微生物宏基因组测序数据，得到每个临床样本中病原微生物和所对应的耐药基因序列数据；对上述病原微生物的序列数据和耐药基因序列数据进行聚类分析，获得单个耐药基因与至少一个疑似来源病原微生物的正态分布模型，选取其中病原微生物丰度高且耐药基因序列数与病原微生物序列数强相关的模型，即得。采用该方法得到的病原微生物耐药基因归属模型，能够判断每种耐药基因究竟来源于哪种细菌，弥补了现有技术的缺陷，且具有适用范围广、准确性高的优点。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种病原微生物耐药基因归属模型及其建立方法和应用。

背景技术

进入20世纪以来，抗生素的发现和应用控制了大部分由细菌引起的感染，明显降低了与感染相关疾病的死亡率。但细菌耐药性的出现和广泛传播为临床抗感染治疗带来极大的挑战。

随着抗菌药物在临床上的广泛应用，细菌常会出现耐药性，造成临床治疗的困难。细菌耐药性可分为：①天然或固有的耐药性，其原因可能由于细菌缺少对药物敏感的靶位，或细菌具有天然屏障致药物无法进入细菌体内有关。②获得耐药性，由于细菌DNA改变而获得耐药性，使原来敏感的细菌变为耐药。其中获得性耐药主要由于耐药基因在可移动原件协助下不同物种间或种内的水平转移，造成细菌耐药，是导致细菌耐药的主要原因。

目前临床细菌耐药检测常采用表型检测法，包括稀释法、扩散法(纸片法)等。其中，稀释法是用含一定量被测菌株的一定培养基将抗菌药物作系列稀释，定量测定抗菌药物抑制或杀灭待测细菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)或最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)。此方法既有定性，又有定量，可比较准确获得耐药信息，但操作繁琐，时间较长。而扩散法(纸片法)是将含有一定量抗菌药物的纸片贴在涂有被测菌株的MH琼脂平板上，置37℃孵育24h，观察有无抑菌圈及其大小。纸片法虽不能定量但简约，是临床常用的方法。目前，临床上也有应用全自动微生物鉴定及药敏分析系统以分析耐药检测，但仍需要经历培养、分离提纯、鉴定三个步骤，至少需要72h提供药敏结果；而且，药敏结果与病原鉴定结果不同步，不能最大化提高临床精准用药。

即上述传统临床药敏检测方法需要时间长，方法操作繁琐、报告结果慢、通量低，往往仍需要先鉴定出菌种，才能进行药敏等后续试验，而难以适应临床治疗需求。

此外，目前市场上也出现了基于固相芯片和基于聚合酶链反应和微流控载体的耐药基因检测试剂盒，分别是采用耐药基因的引物对扩增和特异性探针进行目标序列检测，与基于微流控芯片技术，结合核酸等温扩增技术提供一种耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒。

然而，由于临床样本采集过程不可避免会有皮肤定植菌，例如表皮葡萄球菌，以及核酸提取过程中试剂背景菌存在，这些生态菌或背景菌都可能引入耐药基因；而固相芯片或聚合酶链反应检测病原和耐药基因都属于定性检测，难以建立细菌和耐药基因对应关系，存在假阳性风险，同时，不同耐药基因有同源性，引物设计不合理也容易引入假阳性。

病原宏基因组学(mNGS)是一种不依赖于培养，直接从临床标本提取核酸并检测病原体的高通量测序技术。与传统临床的实验室检测方法相比，病原mNGS是基于核酸水平对序列进行检测，可以突破不同病原体类型的局限性，无偏向性的全面覆盖数千种病原体，同时鉴定细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种类型病原微生物，病原mNGS已逐渐成为临床微生物鉴定领域的重要工具。

但目前常规的病原宏基因组学检测分析，虽能无偏差同时检测病原微生物基因组信息和耐药基因信息，但同样无法建立病原微生物和耐药基因的对应关系，难以为临床提供准确且有意义的耐药基因信息。

发明内容