[发明专利]一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米-RNA制剂

说明书

本发明公开了一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米‑RNA制剂。本发明首次采用神经肽NPF1a基因设计引物并合成了dsRNA，再结合纳米载体透皮传递dsRNA系统，采用喷雾法对梨小食心虫的NPF1a基因进行RNA干扰。采用本发明所提供的纳米‑RNA制剂可以显著降低梨小食心虫的四龄幼虫和初孵幼虫的NPF1a表达量、身体尺寸和蛀果率，并显著增加初孵幼虫的死亡率。且dsRNA不会产生功能蛋白，也减少了对非目标生物的影响，为今后果园直接喷施RNA制剂来防治梨小食心虫的应用性研究打下基础。

技术领域

本发明涉及生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及神经肽NPF1a基因的dsRNA及其在防治梨小食心虫中的应用。

背景技术

梨小食心虫是一种世界性广泛的蛀果害虫。其幼虫喜欢钻蛀和取食一些蔷薇科植物的果实，比如桃、梨、苹果等，这造成果园大面积果实脱落和质量下降及巨大的经济损失。因此有效防控梨小食心虫幼虫的爆发具有重要的研究意义。

梨小食心虫的初孵幼虫是最开始钻蛀取食果实的为害对象，这个为害阶段是实际控制梨小食心虫大爆发的关键时期，因此开展梨小食心虫幼虫取食行为的神经调控研究，既能有助于研发防控梨小食心虫幼虫的潜在靶标分子的RNA制剂，又能对果园害虫的防治有着十分重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米-RNA制剂。为实现上述目的，本发明首次公开了一种梨小食心虫神经肽NPF1a基因的dsRNA，所述dsRNA在与纳米颗粒结合后，经透皮作用进入到昆虫体内，起到抑制NPF1a基因表达的作用，进而抑制梨小食心虫的生长发育及取食行为。

本发明的第一方面公开一种dsRNA，本发明提供的NPF1a基因的dsRNA的核苷酸序列：

GAACAAGAACUUCGCCAUCGCUGUAGCCGUUGUGCUGGCUUGCGUGUGCCUCGCCGAGGCGCGCGAGGAGAGUCCGCACGACAUGUCGGAGGCGCUUCGCAUGCUUCAGGAGUUGGAUCGCUACUACACUCAGGCUGCUAGACCCAGGUUCGGCAAACGCUCUGAUGCCUUCACAAACUGGGCUAAGGAUCUC，如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供的NPF1a基因的dsRNA由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物扩增得到，本发明得到的dsRNA以神经肽NPF1a为靶标分子，结合纳米载体构建透皮双链RNA传递系统，通过室内行为学技术研究证明神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂对幼虫取食行为的调控作用。

本发明第二方面提供使用上述dsRNA制备得到的生物材料，如表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

本发明的第三方面公开一种防治梨小食心虫的产品，其活性成分为上述的dsRNA或上述dsRNA制备得到的生物材料。

这种防治梨小食心虫产品的配方含有纳米颗粒和/或表面活性剂；优选所防治的梨小食心虫为四龄幼虫或初孵幼虫。

通过对配方进一步筛选，发现神经肽NPF1a的纳米-RNA配方为1-5μg/μL纳米载体(Nanocarriers)、1-5μg/μL dsNPF1a、10^-3-10^-4表面活性剂(detergent)对初孵幼虫生存率和蛀果率均有抑制效果。

在使用dsRNA进行昆虫防治时，多采用透皮法或饲喂法导入昆虫体内，均没有提供可在田间应用纳米-RNA制剂的实施方式。

本发明的第四方面提供一种防治梨小食心虫的方法，采用喷雾法喷施含有抑制梨小食心虫神经肽NPF1a基因表达的物质。可进一步推广神经肽NPF1a的纳米-RNA制剂在田间的应用，如：为治理果园中的梨小食心虫，在果园的土壤、树木、果实表面喷施含有抑制梨小食心虫神经肽NPF1a基因表达的物质。