[发明专利]用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法

说明书

本发明属于生物pH和氧气浓度荧光检测的技术领域，具有为用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法。本发明荧光纳米传感器是聚苯乙烯纳米颗粒，其内部疏水，包埋有氧敏感探针，以及pH和氧气惰性的参比荧光探针，其表面修饰有氨基基团，并通过共价连接方式在纳米颗粒表面修饰pH敏感探针。该传感器采用一锅法聚合反应合成得到。该荧光纳米传感器具有生物相容性好、制备简单、灵敏度好、可逆性好的优点，在适当波长的激发光照射下，传感器暴露在不同pH和不同氧浓度环境中，其荧光强度会发生明显变化，可用于细胞内pH和氧气浓度的同时测量。比率型检测方法荧光检测的准确性更高，且细胞毒性极低。

技术领域

本发明属于生物pH和氧气浓度荧光检测的技术领域，具有涉及一种用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法。

背景技术

细胞作为组成生命体的最基本单元，保持细胞功能正常对于维持生命体的健康十分重要。细胞的功能失调与一系列疾病的产生息息相关，如肥胖症、神经性疾病和癌症等。细胞生理活动所需的能量大部分都来源于线粒体呼吸作用。氧气在线粒体呼吸作用的氧化磷酸化环节至关重要，其与还原性分子反应生成水并释放大量能量。能量通过电子传递链传递，驱动了质子逆浓度梯度运输，从而产生线粒体膜电势。质子通过化学渗透的方式回流，释放的能量驱动ATP合成酶的部分旋转，从而将二磷酸腺苷（ADP）转化为三磷酸腺苷（ATP）。此外，氧气浓度过低会引起线粒体功能障碍，而氧气浓度过高可能会促进细胞内活性氧的产生，损害生物分子。同时，细胞内的质子还参与了许多细胞内其他的重要生理活动，例如钙离子信号传导。因此，同时检测细胞内的pH和氧气浓度对于监控细胞生理活动和功能状态具有重要的意义。

荧光传感器由于其检测速度快、灵敏度高、成本低以及对样品无损等特性近年来受到了研究者的青睐。彭洪尚课题组报告了一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器（CN103575717B），该传感器是以十二烷基三甲氧基硅烷-聚苯乙烯和二氧化硅为核，以多聚赖氨酸为壳的核壳结构，氧气探针分散在核层中，通过静电吸附作用表面偶联线粒体靶向基团。虽然其具有较好的氧气响应性能，但是通过沉淀法制备的聚合物纳米颗粒尺寸分布比较不均匀，且颗粒表面呈现化学惰性，难以以共价的方式在纳米颗粒表面修饰其他荧光探针或者靶向基团。虽然具有氧浓度检测功能的荧光传感器可与具有pH检测功能的传感器共同使用实现pH和氧气浓度的同时测定，但是由于传感器在细胞内的分布位置不同，使用多种传感器不利于对细胞内同一位置处的pH和氧气浓度同时进行检测，并且引入多个传感器会增加对细胞正常生理活动的干扰。我们课题组曾报告过一种超小尺寸高稳定性的细胞内pH和氧气同时检测的荧光纳米传感器(Wang et al., 2012)，其将普朗尼克聚合物溶解在水溶液形成核壳结构的胶束，内部疏水包埋了氧敏感探针，外部亲水的PEG层连接pH敏感探针，然后通过在表面形成一层薄二氧化硅来固化结构。独特的结构使其具有良好的pH和氧气检测性能，但是由于其致密的PEG结构，纳米颗粒无法通过胞吞的方式进入细胞，只能通过电穿孔或者显微注射的方式进入细胞。因此，有必要开发一种生物相容性好、制备简单、灵敏度好、可逆性好，能方便地进入细胞并用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物相容性好、制备简单、灵敏度好、可逆性好，能用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法。

本发明提供的用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器，是一种聚苯乙烯纳米颗粒，其内部疏水，包埋有氧敏感探针，以及pH和氧气惰性的参比荧光探针，其表面修饰有氨基基团，并通过共价连接方式在纳米颗粒表面上修饰pH敏感探针；聚苯乙烯材料具有良好的氧气通透性，通过将氧敏感探针和参比荧光染料包裹在纳米颗粒内部，可有效地减少外部环境对荧光检测的干扰，提升氧气检测的准确度。将检测质子浓度的pH敏感探针修饰在纳米颗粒表面，使得其可以充分与外部环境中的质子接触，有利于提升纳米传感器的响应性能。所述的三种荧光探针的发射光谱没有较大发射光谱重叠，可准确地对pH和氧气浓度进行检测。所述的荧光纳米传感器具有均匀的尺寸，良好的生物相容性，可实现细胞内pH和氧气浓度的同时检测。