[发明专利]基于石墨烯光热传感的肺癌标志物miRNA定量检测方法

说明书

本发明涉及一种基于石墨烯光热传感的肺癌标志物miRNA定量检测方法，该方法是利用石墨烯在全反射条件下的古斯汉欣位移效应，并引入经过强度调制的泵浦光，通过锁相放大和平衡探测等弱信号检测技术实时检测由泵浦光引起的石墨烯光热信号。在石墨烯表面接种与肺癌标志物miRNA互补的DNA探针链，通过检测目标miRNA和金纳米小球标记的寡聚脱氧核苷酸链（ODN）的竞争性免疫过程，实现对肺癌标志物miRNA的高灵敏度检测。本发明方法基于石墨烯的光热传感技术，具有免标记、高灵敏度以及微体积检测的优点。

技术领域

本发明基于石墨烯光热传感的肺癌标志物miRNA定量检测方法，属于miRNA检测技术领域。

背景技术

肺癌作为死亡率最高的癌症之一，其发病率和致死率都呈现出逐年增长的趋势，极大地危害着人类的健康。肿瘤标志物的检测有利于癌症的早期发现、早期诊断以及早期治疗，并且可以实时监控患者的治疗效果。肿瘤标志物主要由蛋白质、DNA和RNA组成，在所有的标志物中，miRNA（MicroRNA）作为蛋白转运的调节者，关于其独特性质的研究以及广泛应用于癌症诊断和预后当中可能性的研究已经被大量的开展。miRNA是一类由18-25个核苷酸组成的单链RNA，在细胞的发育、增殖和分化的过程当中起着关键的调节作用。现有研究表明，miRNA参与到了肿瘤发生的每个过程，包括肿瘤的生长、转移和凋亡等，在肿瘤的发生和发展中发挥了重要的作用。因此miRNA的检测在肿瘤的早期诊断和治疗中有着非常好的应用前景。

尽管miRNA的检测对于肺癌的诊断和治疗非常重要，但是由于其序列短、浓度低以及序列同源性高等特点使其检测非常困难，这也促使了研究者发展新型的检测技术，实现对miRNA的高灵敏度检测。目前，常规的miRNA检测技术主要由微阵列以及核酸扩增技术组成。此外，表面等离子体共振、表面增强拉曼光谱法、电化学分析法、以及基于量子点的生物传感器等技术也被用于肺癌标志物miRNA的高灵敏度检测。

miRNA微阵列分析通常是首先将高密度的DNA探针固定在固相载体上，随后与目标miRNA发生相互作用产生检测信号。微阵列技术可用于多种类的miRNA同时检测。然而微阵列的生产与检测成本较高，此外，微阵列上可用样本量少的特点导致了该技术的检测灵敏度较低。因此，微阵列技术通常需要结合荧光、化学发光和电化学检测等方法来提高检测的灵敏度。基于电化学的免疫传感器有着灵敏度高、成本低等优势，在检测生物分子的相互作用中发挥着极其重要的作用。2013年，新加坡国立大学刘志强课题组发展了一种等温信号放大电化学传感器，研究者通过互补金属氧化物来制作检测阵列，以及采用微流控技术代替手动操作等优化，极大地提高了miRNA的检测灵敏度（Anal. Chem. 2013, 85: 4784-4789）。虽然基于电化学的免疫传感器具有制备简单、灵敏度高等优点，但是其稳定性较差，重复性和特异性也有待于进一步提高。表面增强拉曼光谱（SERS）技术有着快速和高灵敏度的检测优势，引起了研究者的广泛关注。SERS技术是一种利用分子吸附在粗糙金属表面，从而显著提升拉曼信号的检测技术，被广泛的应用于检测生物分子之间的相互作用。2016年，南京大学汪联辉课题组发展了基于银纳米棒的快速SERS测量技术，在该技术中，发夹结构的分子信标作为检测肺癌标志物miRNA的载体，研究者以血清中肺癌标志物miRNA-21，miRNA-486，和miRNA-375作为检测物，其检测极限分别达到了393 aM，176 aM，和144 aM（Nanoscale2016, 8: 17365-17373）。虽然SERS技术拥有高灵敏度和快速反应的优点，但是只有金、银、铜和少数碱金属具有SERS效应，因此该技术有着很大的局限性。表面等离子体共振（SPR）技术是一种高灵敏度、无标记的生物传感技术，有着非常好的应用前景。SPR传感技术通过检测待测样本和生物芯片表面的生物分子相互作用引起的折射率变化来进行实时的检测，拥有极高的灵敏度，被广泛的应用于复杂生物介质中低浓度生物分子的检测。2018年，北京大学顾红雅课题组将基于功能化AuNPs的SPR传感器应用于肺癌标志物miRNA-200b的检测，研究者在金膜表面修饰巯基十一烷酸作为连接物，通过优化AuNPs的尺寸以及表面修饰物，检测到的miRNA-200b浓度低至500 pM（Biosens. Bioelectron. 2018, 109:230-236）。但是SPR传感技术假阳性率较高，实验系统容易受温度等外界环境因素影响，这些都限制了该技术的广泛应用。综上所述，研究者针对肿瘤标志物miRNA的检测技术已经开展了大量的研究工作，但是无论是现有的临床诊断技术还是其它种类的检测技术，都有着各自的缺陷。