[发明专利]一种蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备方法

说明书

本发明公开了一种蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备方法，属于医药生物技术领域。操作步骤如下：(1)将新鲜蕨菜，‑50℃以下冷冻干燥，粉碎，获得冻干粉；(2)将冻干粉进行正丁醇冷凝回流提取2遍，合并滤液，减压回收正丁醇得浸膏，冷冻干燥，获得正丁醇提取物；(3)将正丁醇提取物正向硅胶柱层析分离，使用氯仿‑甲醇梯度洗脱，减压浓缩，获得原蕨苷粗品；(4)将原蕨苷粗品进行C18反向柱纯化精制，30％甲醇除杂，45％甲醇洗脱，低温冷冻干燥除去溶剂，获得纯度大于98％的原蕨苷。本发明原蕨苷的提取率可达65％，为药物开发提供了可能；本发明具有分离样品量大、目标物质损失少、提取率高、装置简单、操作简便、适合工业化生产的优点。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及蕨菜中原蕨苷的分离纯化制备方法。

背景技术

蕨(学名:Pteridium aquilinum(L.)Kuhn var.latiusculum(Desv.)Underw.exHeller)是蕨科蕨属欧洲蕨的一个变种，植株高可达1米。根状茎长而横走，密被锈黄色柔毛，以后逐渐脱落；叶远生，柄长20-80厘米，基部粗3-6毫米，褐棕色或棕禾秆色；叶片阔三角形或长圆三角形，长30-60厘米，宽20-45厘米，先端渐尖，基部圆楔形，三回羽状。蕨资源丰富，广布于中国及世界各地。

蕨菜来源于蕨(Pteridium aquilinum(L.)Kuhn)的幼苗、嫩芽，别名拳头菜、如意菜、龙爪菜等，据《本草纲目》记载：蕨味甘寒，具有清热，滑肠，降气，驱风，化痰等功效。蕨菜因其生长在林间、山野、松林内，少受污染，加之富含多种对人体有益的营养成分，为深受人们喜爱的山珍野菜，长期被人们食用，有“山菜之王”之美誉。

19世纪时，人们注意到过量食用蕨菜能造成牛的中毒甚至死亡，1960年，Rosenberger和Heeschen等人通过对牛的蕨菜中毒症状研究中发现蕨菜可能存在致癌作用,1965年，Evans和Mason通过对小鼠喂养蕨菜的实验中，发现小鼠出现了多种肠道癌变现象，表明蕨菜中可能含有某种致癌成分。1983年-1984年，日本科学家Niwa和荷兰科学家Hoeven从蕨菜中分离出来了一种可使实验动物致癌的物质——原蕨苷(Ptaquiloside，简称PTA，CAS：87625-62-5，图1.)，综合已有文献报道表明，在蕨及蕨菜中，原蕨苷的含量在0.0μg/g-12945μg/g，平均含量约为0.64％。

药理活性追踪研究显示，原蕨苷可诱发实验动物的尿道和胃肠道病变出现肿瘤，据此，原蕨苷被世界癌症组织评级为3类致癌物。研究制备原蕨苷的制备方法，获得高纯度原蕨苷，对蕨菜及其产品的安全性评价和质量控制具有重要意义。

Shahin等人研究发现原蕨苷有相关的免疫调节作用，在长期使用原蕨苷的活性物质蕨菜二烯酮能够使单核细胞增多，可以增加肿瘤坏死因子的数目，Latorre等人研究发现同时使用硒进行同时处理或者事后处理时，原蕨苷的这种致癌作用便可以逆转，将硒与原蕨苷进行结合使用，会对癌症有治疗作用。最新的研究显示，原蕨苷等含1-茚酮结构的蕨素倍半萜类物质，具有抗炎、抗风湿、抗阿尔茨海默病/老年痴呆症、抗病毒等生物活性，在药物验研究领域有着广阔的应用前景。蕨及蕨菜资源在我国乃至全世界极为丰富，建立一种从蕨菜中快速制备高纯度原蕨苷的方法，对新药研发和蕨资源的深度开发具有重要意义。

原蕨苷在有机试剂中较为稳定，但在水溶液中不稳定，在热水、酸性及碱性溶剂中极不稳定，极易发生脱糖和芳香化，生成蕨素B(Pterosin B，CAS:34175-96-7，图1)。