[发明专利]一种酶标偶联二抗及其制备方法

说明书

本发明涉及一种酶标偶联二抗，所述酶标偶联二抗是由经修饰的抗体与经修饰的标记酶二者之间以肟键偶联连接；所述经修饰的抗体为抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基，所述经修饰的标记酶为酶分子的赖氨酸残基的氨基被修饰连接芳基醛。本发明的酶标偶联二抗其结构稳定，大小适中，灵敏度高、特异性好，不会因生物体组织自身存在的生物素的干扰而出现非特异性染色，其结构大小适中，尤其适于对一些细胞核内抗原的检测，具有非常高的灵敏度。

技术领域

本发明涉及酶标抗体技术领域，尤其涉及一种酶标偶联二抗及其制备方法。

背景技术

免疫分析是一种基于“抗原-抗体特异性结合”的原理，对生物样品内的蛋白质进行检测继而可定性定量分析的方法，具有灵敏度高和特异性强等优点。酶标二抗在免疫分析中的应用尤为广泛，主要包括免疫组织化学(IHC)，酶联免疫吸附(ELISA)，蛋白免疫印迹(WB)等。

(1)目前市场上的酶标二抗主要有以下三种：1)抗体—酶直接标记法，即通过小分子试剂直接将单个的二抗和HRP酶进行偶联标记。由于标记酶通常体积较大，而抗体表面积和官能团数量有限，因此，每个抗体只能标记非常有限个数的酶分子，容易造成检测灵敏度不足或者抗体特异性降低等问题。2)利用生物素-亲合素放大法，生物素为有机小分子，体积较小，可以较多的标记于二抗分子上且对抗体的特异性和亲和力影响较小，利用生物素与亲合素之间的高亲和力，可以将标有生物素的二抗与标有亲合素的酶分子结合，形成复合物。此方法可大大提高检测的灵敏度，但由于生物体组织自身普遍存在生物素，因此极易出现非特异性染色，对实验结果造成大的干扰。3)链式高分子—酶—抗体聚合物，此方法利用亲水性的链式高分子(比如葡聚糖，多聚赖氨酸多肽等)的链式结构可以先将酶分子标记在其骨架上，然后再与二抗分子连接。这样可以减少标记酶对抗体特异性和亲和力的影响，提高检测灵敏度。然而该方法也存在一定的缺点，链式高分子—酶—抗体聚合物整体结构较为松散、体积较大，进入细胞核膜时具有一定的阻力，对检测一些细胞核内抗原的灵敏度不够。因此，获得一种稳定性好，特异性强，灵敏度高的酶标二抗具有十分重要的意义。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种酶标偶联二抗，其结构稳定，大小适中，灵敏度高、特异性好，不会因生物体组织自身存在的生物素的干扰而出现非特异性染色，其结构大小适中，尤其适于对一些细胞核内抗原的检测，具有非常高的灵敏度。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种酶标偶联二抗，是由经修饰的抗体与经修饰的标记酶二者之间以肟键偶联连接；所述经修饰的抗体为抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基，所述经修饰的标记酶为酶分子的赖氨酸残基被修饰使酶分子变为芳基醛。

根据本发明较佳实施例，所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种。

根据本发明较佳实施例，所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

第二方面，本发明提供一种酶标偶联二抗的制备方法，其包括：

S1:对抗体进行修饰，使抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基；

S2:对标记酶进行修饰，使酶分子的赖氨酸残基的氨基被修饰连接芳基醛；

S3:在弱酸性水溶液中，经修饰的标记酶所含的芳基醛与经修饰的抗体所含的氨基氧基发生缩合反应形成肟键，得到以稳定的肟键连接的酶标偶联二抗。

根据本发明的较佳实施，S3中，加入苯胺作为催化剂，催化肟键生成。S1和S2中修饰成功与否可通过凝胶层析柱判断，分子量变大表示在抗体或标记酶上引入了相应的基团。