[发明专利]一种R-选择性苯乙烯单加氧酶的功能

说明书

本发明公开了一种来源于Streptomyces exfoliatus sp.A1013Y的新型苯乙烯单加氧酶SeStyA及其在催化不对称环氧化中的应用。该酶与传统的苯乙烯单加氧酶相比，对苯乙烯类底物具有相反的选择性，生成的环氧产物为R型，且该酶具有较宽的底物谱，催化溴和氯取代苯乙烯等底物均有活性。本发明为R型环氧化合物的生物催化制备提供了可供选择的新酶源。

技术领域

本发明涉及一种新型苯乙烯单加氧酶SeStyA的催化功能，经该酶催化苯乙烯类底物可获得R-构型环氧产物，属于应用微生物及酶工程领域。

背景技术

手性环氧化物是有机合成中的重要组成部分，它们被广泛用作合成活性药物成分、天然产品、香料和香精、其他精细化学品和高级聚合材料的中间体。与化学催化相比，酶催化具有优异的立体选择性、温和的反应条件以及对环境友好等优点，因此近年来生物催化已成为有机合成中的重要手段。苯乙烯单加氧酶(Styrene Monooxygenase,SMO，EC1.14.14.11)是由单加氧酶(StyA，EC 1.14.14.11)和黄素还原酶(StyB，EC 1.5.1.36)组成，其中单加氧酶StyA组分决定环氧化反应的立体选择性。SMO以FADH₂作为电子供体，可立体选择性催化苯乙烯及其衍生物环氧化生成相应的环氧化合物。SMOs首次报道于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)物种中，研究者对已报道的10余个苯乙烯单加氧酶进行了深入研究，这些SMOs序列相似度高，酶学性能差异较小，并且催化形成的环氧化合物的立体选择性单一，野生型酶催化只能生成S构型的环氧产物，且试图通过酶的人工进化得到相反构型的产物也非常困难，限制了其应用范围。

随着全基因组测序技术的不断发展，NCBI数据库中已经公布了大量的基因序列，为我们提供了丰富的酶资源库，通过数据库挖掘的方法是寻找新型苯乙烯单加氧酶的有效途径。目前，仅报道了一个来源于链霉菌的苯乙烯单加氧酶 StStyA能催化生成R构型环氧产物(Enzyme Microb.Tech.2020,132:109391)。但是该酶催化效率较低，立体选择性也有待提高，底物谱范围窄，因此进一步深入挖掘出更多优异的R型SMOs很有必要。

发明内容

本发明目的是公开一种来源于Streptomyces exfoliatus sp.A1013Y新型苯乙烯单加氧酶SeStyA的功能，并提供了该基因构建的重组菌用于催化不对称环氧化反应的方法。

该新型苯乙烯单加氧酶SeStyA的特征是：核苷酸长度为1284bp，序列为 SEQ IDNo.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明的苯乙烯单加氧酶SeStyA基因是通过NCBI数据库挖掘的方法获得，之后通过分子克隆构建相关载体并进行异源表达及生物转化，从而得到了R型环氧产物。

根据本领域公共知识，构建的相关载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

本发明的苯乙烯单加氧酶SeStyA是通过基因组数据库挖掘的方法获得的：我们以已报道的来源于Streptomyces sp.NRRL S-3的StStyA蛋白序列 (GenBank登录号WP_030740546.1)为参考序列在NCBI数据库中进行 BLAST，选取相似度大于49％的序列，通过系统发育分析后选取目的基因，由上海生工生物工程有限公司合成，并连接至pET28a(+)载体，上、下游限制性内切酶位点分别为EcoR I/Hind III，获得的质粒命名为pETSeStyA。