[发明专利]一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用。本发明所述反式丁烯酸转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述反式丁烯酸转氨酶可有效催化反式丁烯酸生产R‑3‑氨基丁酸，并且采用本发明方法可实现所述反式丁烯酸转氨酶的工业化生产，为生物酶法大量制备R‑3‑氨基丁酸提供了必备条件。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用。

背景技术

R-3-氨基丁酸主要作为医药中间体R-3-氨基丁醇的前体物，R-3-氨基丁醇是度鲁特韦(dolutegravir)的关键中间体。度鲁特韦是一种人类免疫缺陷病毒类型1(HIV-1)整合酶抑制药，适用于与其它抗逆转录病毒药联用治疗12岁以上和体重至少为40kg儿童的HIV-1感染。度鲁特韦于2013年08月12日获得FDA批准上市，2019年全球销售额超过20亿美元。R-3-氨基丁酸可通过生物酶法制备，如中国发明专利CN108374027B公开了一种R-3-氨基丁酸的制备方法，该方法是以巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，用氨水调节pH，然后加入天冬氨酸酶作为生物酶催化剂，在适宜温度和碱性条件下反应，反应后经分离、纯化、结晶，获得R-3-氨基丁酸。其中，所述天冬氨酸酶的获得方法是：以芽孢杆菌菌液为模板，按照GenBank上公开的芽孢杆菌天冬氨酸酶基因序列设计一对引物，随后进行PCR扩增，将PCR扩增片段和载体进行双酶切并纯化，随后按适量的比例将目的片段和载体进行连接构成重组质粒，加入感受态细胞进行转化构成重组菌株，将重组菌株涂布在相应抗性的平板中进行培养。

该专利虽然公开了采用天冬氨酸酶可催化反式丁烯酸生产R-3-氨基丁酸，但是其并未具体公开所述天冬氨酸酶工业化生产的工艺，仅是公开了实验室摇瓶发酵工艺。而且发酵过程中的中试是从小试实验到工业化生产必经的过渡环节，由于发酵中试放大并非所有参数直接线性放大，需要综合考虑罐体温度、溶氧、菌体、补料速度等传质、扩散动力学因素，这些因素会造成发酵中试结果与小试差别很大，而且有可能在不同的发酵阶段，采用不同的参数控制方式，这些都是在摇瓶小试时无法做到的。在此基础上人们很难得到可满足1000L生物催化反应体系所需的重组天冬氨酸酶的用量。

而天然的天冬氨酸酶用于催化富马酸和氨生成天冬氨酸，无法催化反式丁烯酸转化为R-3-氨基丁酸。因此，提供一种可工业化生产的可催化反式丁烯酸生产R-3-氨基丁酸的天冬氨酸酶及其生产工艺，对于生物医药行业具有重要的意义。

发明内容

本发明主要目的在于提供一种反式丁烯酸转氨酶及其高密度发酵制备方法和应用。本发明所述反式丁烯酸转氨酶可有效催化反式丁烯酸生成R-3-氨基丁酸，并且采用本发明方法可实现所述反式丁烯酸转氨酶的工业化生产，为生物酶法大量制备R-3-氨基丁酸提供了必备条件。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一提供一种反式丁烯酸转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明目的之二提供一种编码以上所述反式丁烯酸转氨酶的but基因，所述but基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明目的之三提供一种反式丁烯酸转氨酶工程菌，所述工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为载体，表达反式丁烯酸转氨酶but基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明目的之四提供所述反式丁烯酸转氨酶工程菌的高密度发酵方法，所述方法包括以下步骤：

所述工程菌种子液培养；

将种子液接种到发酵培养基中，进行高密度发酵培养；

高密度发酵培养过程中添加诱导剂，补加碳源、氮源，控制溶氧量。