[发明专利]一种基于DNA损伤修复缺陷活细胞彗星检测水体中有机污染物毒性的方法

权利要求书

1.一种基于DNA损伤修复缺陷活细胞彗星检测水体中有机污染物毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采集水样富集物，将所述水样富集物处理DNA 损伤修复缺陷活细胞，同时以所述水样富集物处理的DNA 损伤修复正常活细胞作为对照；将上述处理的DNA损伤修复缺陷活细胞和正常活细胞分别离心沉淀，再用PBS重新悬浮细胞，离心得到第一细胞悬液，备用；

所述DNA损伤修复缺陷活细胞由鸡B淋巴细胞DT40敲除DNA修复基因TDP1和/或TDP2后得到；所述DNA损伤修复缺陷活细胞为TDP1 KO细胞系或TPD2 KO细胞系，所述TDP1 KO细胞系由鸡B淋巴细胞DT40敲除TDP1基因上如SEQ ID NO:1所示的基因片段后得到，所述TPD2KO细胞系由鸡B淋巴细胞DT40敲除TDP2基因上如SEQ ID NO:2所示的基因片段后得到；

（2）将所述步骤（1）处理后得到的第一细胞悬液制备成彗星电泳载玻片细胞样品；

（3）将所述步骤（2）后得到的彗星电泳载玻片细胞样品去掉盖玻片，浸入碱性裂解液中进行细胞裂解，然后取出裂解后的载玻片，放入电泳槽电泳，电泳结束后将载玻片细胞样品进行中和处理；

（4）中和完毕后在载玻片细胞样品上滴加DNA荧光染料，加盖盖玻片，用荧光显微镜观察慧星变化，测量经过所述水样富集物处理的DNA损伤修复缺陷活细胞和正常活细胞的慧星尾矩值，得到DNA慧星迁移尾矩值。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，采集水样富集物的方法，具体包括如下步骤：采集水样，静置一段时间后，过滤去除悬浮颗粒，通过大孔树脂吸附柱富集，再用氮气去除水分，依次用甲醇、丙酮和二氯甲烷洗脱，得到的洗脱液进行浓缩、吹干，最后用二甲基亚砜溶解，得水样富集物；所述第一细胞悬液的细胞浓度为 0.5-1.0x10⁵个细胞/mL。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述大孔树脂为XAD-2、XAD-4、XAD-7、XAD-8或XAD-2/XAD-8 树脂；所述静置的时间为24-36h；所述浓缩的温度为45-50℃；所述水样富集物在-18℃至-70℃下避光保存备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述彗星电泳载玻片细胞样品的制备方法，具体包括如下步骤：将正常熔点琼脂糖铺滴在磨砂载玻片上，迅速盖上盖玻片，进行固化，得到第一层胶；向步骤（1）处理后得到的第一细胞悬液中加入等体积的低熔点琼脂糖溶液，吹打均匀形成第二细胞悬液，取第二细胞悬液铺滴至所述第一层胶上，盖上盖玻片，进行固化，得到第二层细胞胶，完成彗星电泳载玻片细胞样品的制备。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述正常熔点琼脂糖的熔点为大于90℃，其质量浓度为0.6%；所述低熔点琼脂糖的熔点为42-65℃，其溶液质量浓度为1.2%；固化温度为0-4℃，固化时间为30~120min。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述碱性裂解液包括0.5M EDTA和5M NaCL，碱性裂解液pH=13，用前加入体积浓度1%的Triton X-100和体积浓度1%的二甲基亚砜；所述碱性裂解液的温度为4℃，细胞裂解温度为4℃，裂解时间为10~120min。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述电泳的具体操作包括如下步骤：向电泳槽中注入pH=13.0的碱性电泳液，静置30-45 min后开始电泳，电流为200～300 mA，电压为12~25 V，电泳时间为20~30 min；电泳结束后将载玻片置于Tris-HCL缓冲液中进行中和漂洗5-10分钟，所述Tris-HCL缓冲液的浓度为0.4 M，漂洗次数为3次，每次漂洗时间为15min。

8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述DNA荧光染料为1xSYBR Green I 溶液，用荧光显微镜观察彗星，获取彗星图像后，用CASP软件分测量经过所述水样富集物处理的DNA损伤修复缺陷活细胞和正常活细胞的慧星尾矩值，得到DNA慧星迁移尾矩值。