[发明专利]一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法

说明书

本发明公开了一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法，属于食品微生物分析技术领域。该方法包括采集南美白对虾样本分别于不同温度条件下贮藏，均质处理，得到的样本匀浆液进行PMA前处理，提取活菌宏基因组DNA后进行16SrDNA特异引物的PCR扩增，构建克隆文库，用测序平台进行边合成边测序的深度测序，运用生物信息学技术对南美白对虾样本中活菌多样性进行分析。本发明首次提出PMA前处理与高通量测序相结合构建南美白对虾中活菌多样性分析模式，测序周期短、生成数据量大、信息较为全面、准确率高且成本低，解决传统微生物多样性分析技术无法区分死菌和活菌的问题。

技术领域

本发明涉及一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法，属于食品微生物分析技术领域。

背景技术

南美白对虾在贮藏期间常受到温度等外在因素的影响产生腐败，出现黑变，发出恶臭、滋生致病菌等品质败坏现象，从而严重影响对虾的对内销售和对外出口贸易。大量研究表明，南美白对虾生产、加工、贮藏及流通过程中，微生物是影响其食品安全的重要因素。因此，构建一种有效、可靠、国际通用的南美白对虾中微生物多样性分析方法，对于提升水产安全、维护公众健康具有十分重要的科研价值和实际意义。

传统基于微生物培养的方法不仅耗时费力，而且无法鉴定自然环境中99％以上的微生物。随着微生物学和分子生物学技术的迅猛发展，以16srDNA为基础的微生物群落多样性分析手段逐渐建立起来，如单链构象多态性(SSCP)、长度多态片段PCR(LH-PCR)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)等。然而，此类方法仍具有通量低和信息量小等缺点，仅能检测到样品中的优势种群，严重制约了在微生物多样性分析中应用。高通量测序技术又称“第二代”测序(NGS)技术，可以切实有效的解决上述难题，具有测序周期短、生成数据量大、信息较为全面、准确率高以及成本低等优点，使其在微生物多样性研究中具有独特的优越性。目前，运用高通量测序分析微生物多样性的技术已经日趋成熟，在人体、水源、土壤、食品等样本中广泛应用。然而，这种技术存在一个极大的缺陷，基于DNA扩增的技术均无法区分样品中的死菌和活菌，从而干扰了微生物多样性分析的准确性。

叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide，PMA)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏反应染料，能够进入细菌的死细胞中，选择性地交联死菌的DNA，将其与DNA扩增检测技术相结合，可有效地抑制死菌细胞DNA的扩增。近年来，利用PMA结合实时荧光PCR技术，已经广泛应用于多种食源性致病菌的活菌检测，被认为是目前最为有效的新型活菌检测技术。然而，目前还没有将PMA前处理与高通量测序相结合，进行南美白对虾中活菌多样性分析的研究报道。

发明内容

为解决传统微生物多样性分析技术无法区分死菌和活菌的问题，本发明的目的在于提供一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种南美白对虾中活菌多样性分析模式构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)采集南美白对虾样本，分别于不同温度条件下贮藏；

(2)将不同贮藏温度的样本分别均质处理，对所得的样本匀浆液进行叠氮溴化丙锭(PMA)前处理；

(3)提取经PMA前处理的样本中活菌宏基因组DNA；

(4)用双标签进行引物对融合后，对提取的活菌宏基因组DNA进行16SrDNA特异引物的PCR扩增，构建克隆文库；

(5)对合格的克隆文库用Illumina Miseq测序平台进行边合成边测序的深度测序；

(6)运用生物信息学技术通过深度测序对南美白对虾样本中活菌多样性进行分析。

一些实施例中，步骤(1)中，所述南美白对虾由采集到贮藏整个过程不超过一个小时，贮藏温度分别为4℃和7℃。