[发明专利]检测新发鸭4型腺病毒的实时荧光定量PCR引物及试剂盒

说明书

本发明提供用于检测新发鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV‑4)的实时荧光定量PCR引物及试剂盒，引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，具有很高的特异性和灵敏度。本发明建立的方法能够对鸭群中新发鸭4型腺病毒感染进行检测和定量，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其扩增曲线结合熔解曲线峰值(Tm值)即可直接对结果进行判断，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术领域

本发明属于兽医学领域，具体涉及一种用于检测新发鸭4型腺病毒(duckadenovirus 4，DAdV-4)的实时荧光定量PCR引物及试剂盒。

背景技术

鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV-4)是2019年在我国南方地区发现一种鸭新型腺病毒病。对该病毒基因组进行分析发现，其主要基因编码蛋白均和鸭群中前期发现的鸭1型腺病毒、鸭2型腺病毒和鸭3型腺病毒相关基因的核苷酸和氨基酸同源性均低于80％。遗传进化分析表明，DAdV-4属于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)，但处于一个独立的遗传进化分支，将其命名为鸭4型腺病毒(duckadenovirus 4，DAdV-4)。2020年，本研究团队在福建地区鸭群中也证实存在鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染(命名为DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)，测定的DBP基因和鸭4型腺病毒参考株GD-2019株(GenBank登录号MN733730)核苷酸同源性为100％。

实时荧光定量PCR方法(Real time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。但是，当前国内外尚未见基于饱和荧光染料EvaGreen对鸭4型腺病毒进行检测实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域研究空白。

发明内容

本发明的目的在于提供检测鸭4型腺病毒的EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，建立能够对鸭4型腺病毒进行检测的实时荧光定量PCR检测方法，该方法不仅能够对鸭4型腺病毒进行检测，还具有检测快速、高效、特异性强、敏感性高的特点。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种用于检测新发鸭4型腺病毒的实时荧光定量PCR引物，所述引物如下：

DAdV-4-SYF1：5’-GCGATAGCGAAACTAGACCTATAC-3’，

DAdV-4-SYR1：5’-TAACTCCGATGCAAAGACGTAG-3’，

目的片段大小为101bp。

一种含有所述引物的检测新发鸭4型腺病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒。

EvaGreen实时荧光定量PCR反应体系为：

实时荧光定量PCR反应体系(20μL)为：EvaGreen Mix混合液10.0μL、上/下游引物(DAdV-4-SYF1、DAdV-4-SYR1)(10μmol/L)各0.4μL、模板1μL、用灭菌双蒸水补足至20μL。最佳反应条件为：95℃1min预变性；95℃10s、55℃30s、72℃30s，共40个循环。反应结束后，做出熔解曲线。

结果判定：当检测到阳性扩增信号，且熔解曲线Tm＝(85.76±0.12)℃出现单一的特异性峰判为DAdV-4阳性。

本发明提供检测鸭4型腺病毒的EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，具有以下优点和效果：