[发明专利]一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品及其应用

说明书

本发明公开了一种用于识别假阳性反应的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品及其应用。本发明所述的结核分枝杆菌sRNA荧光定量PCR标准品的理论TM值较野生序列的相差4‑6℃，可在定量PCR检测中，快速、实时、准确监测由标准品引起的污染，避免传统的试剂盒标准品组件与样本间的交叉污染，影响对样本的准确定量。本发明识别标准品污染简单方便，无需额外仪器和操作步骤，仅通过对定量PCR熔解曲线的识别，便可实时快速判定任何可能的标准品扩增污染，节省人力物力，经济性高。

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌sRNA标准品的设计、制备和实时定量PCR检测，能够在结核分枝杆菌sRNA的荧光定量PCR检测中、确定标准品污染所致假阳性反应。本发明属于微生物学领域。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的小RNA(small RNA，sRNA)是在菌体中表达量较高，有二级结构，具有稳定性的一类RNA；在感染组织中，MTB的sRNA高表达。研究表明，在结核分枝杆菌感染的小鼠肺组织中，MTS0997、MTS1338和MTS2823这三种结核分枝杆菌sRNA的表达水平最高([1]DV I,OIu T,NN L,et al.ExpressionofMycobacterium tuberculosis small RNAs in mice models oftuberculosis.Bioorganicheskaia khimiia,2014.40(2):253-256.[2]KB A,I C,NR T,etal.Sequence-based analysis uncovers an abundance of non-coding RNA in thetotal transcriptome of Mycobacterium tuberculosis.PLoS pathogens,2011.7(11):e1002342.)。所以，对MTB sRNA的检测有利于进一步深入研究sRNA的作用、探索MTB sRNA作为特异性诊断标志物的价值。

近年来，在临床病原微生物核酸的检测中，实时荧光定量PCR技术应用广泛。但该技术要求严格的质量控制，以避免检测中污染的产生。即便如此，作为一种核酸扩增技术，典型的PCR可产生多达10⁹个目标序列拷贝，如果雾化，即使最小的雾化也会含有多达10⁶个扩增产物。因此，检测体系中微量的污染就会造成大量的扩增产物，严重影响检测结果。PCR检测过程中的污染来源除了大量操作的样本导致的交叉污染，更多的来自于标准品的序列。因为，质粒等标准品在单位容积内浓度高，在纯化过程中需要较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖及其很强的生命力，其污染环境的可能性也很大。经重复扩增相同的目标序列后可能大量的累积并存在于实验室环境中。所以在分子生物学实验室中因标准品引起的PCR污染比较常见。

对于PCR污染的防控，目前已报道的方法主要针对于反应过程中已出现的污染处理，例如，丁旭等人发明的“一种防止PCR污染的方法及其应用”(公开号CN106337045A)，在常规PCR反应体系中加入一定量的Benzonase核酸酶，去除PCR反应体系中的外源微生物或气溶胶污染的DNA；姚见尔等人发明的“一种利用限制性内切酶防止PCR污染的方法”(公开号CN101768629A)，在PCR反应体系中加入IIS型限制性内切酶，从而消化反应体系中可能存在的污染物。

但是，在PCR检测中，对污染的快速、早期的确认和识别是至关重要的。这不仅有利于快速判别检测的假阳性结果、避免检测结果的误判，更有利于早期识别污染来源，从而利于操作人员追踪污染来源，在后续检测中有针对性的对已识别的污染进行处理和过程把控。然而，针对较为常见的标准品的污染问题，目前市面上还没有较为成熟的产品加以解决。所以迫切需要一种实时、快速、经济、方便的PCR污染识别方法，减少假阳性结果的出现，利于快速对PCR污染进行防控处理。

发明内容