[发明专利]一种交替糖蔗糖酶表达及其制备交替糖的方法

说明书

本发明公开了一种交替糖蔗糖酶表达及其制备交替糖的方法，属于酶工程技术领域。构建的毕赤酵母工程菌(Pichia pastoris X33/pPICZa‑ASR)，经3L发酵罐高密度发酵，所产交替糖蔗糖酶酶活达到34.5U/mL以上，实现了交替糖蔗糖酶的高效表达。以蔗糖为供体，以其他小分子糖为受体，利用重组工程菌生产的交替糖蔗糖酶催化合成交替糖。本方法实现了交替糖蔗糖酶的高效表达，展现良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种交替糖蔗糖酶表达及其制备交替糖的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

交替糖蔗糖酶具有α-转糖苷活性，可以以蔗糖为底物生产交替糖。交替糖(alternan)包括交替糖多糖(polyalternan)和交替糖寡糖(oligoalternan)，含有交替连接的α-1,6糖苷键与α-1,3糖苷键。交替糖多糖是一种新型的胞外多糖，平均分子量Mr在1×10⁶-1×10⁷Da，聚合度DP在1×10⁴以上。交替糖寡糖是一种新型功能性低聚糖，平均分子量Mr在540-1800Da，聚合度DP在3-10。交替糖因其独特结构所赋予的特殊的性能，使其具有多种生理功能及加工特性。尤其是其独特的低热值、抗酶解、抗微生物降解、耐酸、耐热特性，使其在医药、化妆品、饲料、保健、食品和印刷工业以及化妆品工业具有巨大的应用前景。但是，交替糖在自然界中的含量较少，交替糖主要是通过发酵制备和酶法制备获取。

虽然国内外已经对交替糖蔗糖酶的来源、性质、生化特性、作用机理等方面的研究，并取得了一定的研究成果，但是总的来说，所获得的交替糖蔗糖酶在纯度和比活方面依然比较低，不能满足大规模工业化生产的要求。目前，交替糖生产菌株发酵生产交替糖的产量和转化率均比较低，现有文献报道构建表达的交替糖蔗糖酶酶活为3.9U/mL，严重制约了交替糖的大规模工业化制备，限制了交替糖的广泛应用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因，如SEQ ID NO.2所示序列。

本发明第二个目的是提供一种高效异源表达交替糖蔗糖酶的重组毕赤酵母，其含有SEQ ID NO.2所示序列。

在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母(Pichiapastoris)X33为宿主，以pPICZα为表达载体。

本发明第三个目的是提供含有所述基因如SEQ ID NO.2所示的重组毕赤酵母的构建方法。

在本发明的一种实施方式中，所述SEQ ID NO.2所示的基因是Leuconostoccitreum NRRL B-1355来源的交替糖蔗糖酶经密码子优化获得的。

在本发明的一种实施方式中，将SEQ ID NO.2所示基因序列插入到表达载体pPICZα的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得表达载体pPICZα-ASR。

在本发明的一种实施方式中，用限制性内切酶SacⅠ线性化重组表达载体pPICZα-ASR，电转到毕赤酵母(Pichiapastoris)X33中，并涂布在含有50～600ug/mL zeocin的YPD固体培养基上28-30℃培养约24-48h。筛选正确的转化子，经摇瓶发酵筛选获得重组酶活性高的菌株，为Pichiapastoris X33/pPICZα-ASR。

本发明第四个目的在于提供利用上述重组毕赤酵母生产交替糖蔗糖酶的方法，采用甲醇诱导策略发酵生产交替糖蔗糖酶。

在本发明的一种实施方式中，从培养有重组毕赤酵母的平板上挑取单菌落接种于YPD培养基中，30℃，220rpm培养24h作为种子液。

在本发明的一种实施方式中，将获得的种子液以8～20％(v/v)的接种量接种于3L发酵罐中，装液量30-60％(v/v)的发酵培养基中。