[发明专利]联合金纳米探针和CRISPR-Cas的蛋白标志物检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及化学、生物技术领域，具体涉及了一种联合金纳米探针和CRISPR‑Cas的蛋白标志物检测方法。将免疫分析、纳米技术和CRISPR检测技术三者相结合，通过在金纳米粒子上共价连接适配体和CRISPR激活链得到金纳米探针。通过抗体与适配体对蛋白标志物的特异性识别作用，在96孔酶标板中形成抗体‑分析物‑金纳米探针的夹心结构。金纳米探针上的激活链可以激活CRISPR蛋白的旁切割活性，切割荧光报告分子产生荧光信号，从而对分析物进行定量检测。本发明利用金纳米探针实现了分析物识别信号到CRISPR旁切割活性信号的转化，同时实现了激活链信号的放大。所述检测方法操作简单、灵敏度高、特异性强和检测线性范围宽。

技术领域

本发明涉及化学、生物技术领域，具体涉及一种联合金纳米探针和CRISPR-Cas的蛋白标志物检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近些年来，CRISPR系统的发现和研究为核酸检测提供了全新的方法，这些方法主要依靠荧光信号来检测样品中目标核酸分子的浓度。目前用于核酸检测的CRISPR蛋白有Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14和Csm6等具有旁路切割活性的Cas蛋白。其中Cas12a蛋白分子与crRNA结合，形成crRNA-Cas12a复合体，目标单链DNA分子或者双链DNA分子与crRNA特异性结合，激活CRISPR蛋白的旁路核酸切割活性，任意切割单链DNA分子；此外，Cas13a蛋白形成crRNA-Cas13a复合体后，特异性结合目标单链RNA分子，激活旁路核酸切割活性，任意切割单链RNA分子；Cas14形成crRNA-Cas14复合体后，特异性结合目标单链DNA分子，激活旁路核酸切割活性，任意切割单链DNA分子。由于它们进行检测的原理大都相似，其它基于激活CRISPR蛋白旁路切割活性的检测原理不再赘述。除核酸检测外，CRISPR蛋白也逐渐被应用于检测其他分子，这些策略需要借助媒介将分析物的识别信号转化为CRISPR蛋白的旁路切割活性信号，CRISPR的旁路切割活性是由其目标核酸链(激活链)激活的。通常为了提高检测的灵敏度，在进行CRISPR反应前会将激活链进行核酸扩增，常用的扩增方法有聚合酶链式反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)等，然而这些方法通常需要使用专门的仪器、成本较高且易导致样品间的交叉污染。另外，将分析物的识别信号转化为CRISPR旁路切割活性信号、激活链核酸扩增这两部分通常是分步进行的，这使得操作程序更为复杂。最后，为了检测不同的分析物，通常需要有针对性的设计不同的激活链和crRNA，这使得操作程序更为复杂，且增加反应成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种联合金纳米探针和CRISPR-Cas的蛋白标志物检测试剂盒及检测方法，利用一种修饰有激活链和适配体的金纳米探针。一方面，通过适配体对分析物的特异性识别，可实现分析物识别信号到CRISPR旁路切割活性信号的转化；另一方面，金纳米探针上连接了大量的激活链，可用来代替PCR、LAMP等核酸扩增步骤。

为此，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种金纳米探针，所述金纳米探针由适配体和激活链同时共价连接到金纳米粒子上。

其中，所述适配体为单链DNA或单链RNA中的其中一种。

其中，所述适配体包括但不仅限于PSA(前列腺癌特异性抗原)适配体，PSA适配体也可以替换成CEA(癌胚抗原)适配体，用来检测待测样本中的CEA的含量；PSA适配体也可替换成其它蛋白标志物的适配体或者对其它生物分子的适配体。

其中，所述激活链为单链DNA、双链DNA或单链RNA的其中一种。

其中，所述激活链可激活CRISPR蛋白的旁路核酸切割活性。

其中，所述适配体和激活链均为5’端修饰SH C₆的核酸链。

第二方面，本发明内容还包括所述金纳米探针的构建方法：将金纳米粒子与适配体和激活链通过共价连接得到金纳米探针。