[发明专利]一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法

权利要求书

1.一种海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计合成GhNSP基因的sgRNA1和sgRNA2；

2)将sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体中；

3)将步骤2)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体在农杆菌的介导下转化陆地棉材料，筛选获得陆地棉突变体材料；

4)将所述陆地棉突变体材料和海岛棉进行杂交，对杂交后代进行Hi-Tom检测，筛选含CRISPR/Cas9与sgRNA的T-DNA片段、敲除GhNSP基因的杂交后代，得到海岛棉杂交后代雄性不育材料；

所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述筛选含CRISPR/Cas9和sgRNA的T-DNA片段的方法是利用gRNA1-Hi-Tom-gb-S和gRNA1-Hi-Tom-AS引物对检测gRNA1，用gRNA2-Hi-Tom-gb-S和gRNA2-Hi-Tom-AS引物对检测gRNA2；

gRNA1-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

gRNA1-Hi-Tom-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

gRNA2-Hi-Tom-gb-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

gRNA2-Hi-Tom-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

2.根据权利要求1所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤2)中sgRNA1和sgRNA2串联构建到CRISPR/Cas9基因编辑载体的方法，包括以下步骤：

A.以pGTR载体为模板，分别扩增含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2；

B.将所述含所述sgRNA1的目标片段1和含所述sgRNA2的目标片段2利用重叠延伸PCR方法连接形成串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段；

C.将所述串联有sgRNA1和sgRNA2的长片段插入pRGEB32-GhU6.7-NPT II载体中，得到含sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

3.根据权利要求2所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤A中所述扩增含所述sgRNA1的目标片段1用引物对为inf-pRGER32-7-S和GhNSP-CRISPR-1-AS；

所述inf-pRGER32-7-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述GhNSP-CRISPR-1-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.根据权利要求2所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，步骤A中所述扩增含所述sgRNA2的目标片段2用引物对为GhNSP-CRISPR-2-S和GhNSP-CRISPR-2-AS；

所述GhNSP-CRISPR-2-S的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述GhNSP-CRISPR-2-AS的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

5.根据权利要求2～4任意一项所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，所述重叠延伸PCR方法中所用的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的inf-pRGER32-7-S和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的infGhNSP-CRISPR-AS。

6.根据权利要求1所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，所述陆地棉材料包括Jin668。

7.根据权利要求1～4和6任意一项所述海岛棉杂交后代雄性不育材料的创制方法，其特征在于，所述海岛棉包括新海35号。