[发明专利]具有延长的保存期的过氧化物酶化学发光底物

说明书

一种用于进行测定样品中的分析物的分析的试剂盒，该试剂盒具有延长的保存期，其中该试剂盒包含化学发光环状二酰肼、增强剂、共增强剂和过氧化物氧化剂。该试剂盒可用于检测蛋白质和核酸分子的印迹分析和免疫分析中。

技术领域

本发明涉及一种用于在测定样品中的分析物的分析中测定过氧化物酶的化学发光底物，其中该化学发光底物具有延长的保存期。

背景技术

辣根过氧化物酶(HRP)催化的鲁米诺化学发光氧化广泛应用于抗原、抗体和核酸的分析测试，尤其是印迹测试，例如斑点印迹和蛋白质印迹(蛋白质)、DNA印迹和RNA印迹(核酸)以及酶联免疫分析(EIA，用于蛋白质或核酸)。

已知通过添加电子介体或增强剂，可以使得HRP催化的鲁米诺的化学发光氧化变得更快和更高效，如例如Kricka LJ(1991),Clinical Chemistry,37:1472-1481或KrickaLJ,Voyta JC和Bronstein I在Chemiluminescent Methods for Detecting andQuantitating Enzyme Activity(2000),Methods Enzymol；305:370-390中所述的。

其中鲁米诺和增强剂同时氧化的增强化学发光反应(ECL)的机理已描述如下[Lind J，Merenyi G和Eriksen TE(1983)，J Am Chem Soc，105:7655-7661]。在ECL的第一步骤中，增强剂(E)(其是比鲁米诺具有更高活性的HRP的底物)根据“乒乓”机制在HRP的存在下被过氧化氢氧化：

HRP+H₂O₂→HRP-I (1)

HRP-I+E→HRP-II+E^● (2)

HRP-II+E→HRP+E^● (3)

其中E是增强剂，E^●是增强剂的单电子氧化的自由基产物，HRP是处于Fe(III)静息状态的辣根过氧化物酶，HRP-I和HRP-II是过氧化物酶的氧化中间体，其分别比静息状态高两个和一个氧化当量。然后，增强剂的自由基产物(E^●)与鲁米诺分子(LH^-)可逆地反应[Easton PM,Simmonds AC,Rakishev A,Egorov AM和Candeias LP(1996),J Am Chem Soc；118:6619-6624]：

在热力学上，氧化还原平衡(4)的位置由实验条件下增强剂和鲁米诺自由基的还原电位之间的差异决定。一旦形成，两个鲁米诺自由基(L^●-)歧化成鲁米诺阴离子(LH^-)和二杂氮醌(diazaquinone)中间体(L)：

2L^●-→LH^-+L(5)

二氮杂醌中间体(L)与过氧化氢反应而生成过氧化鲁米诺(LO₂^2-)，其随着分子氮的排出而折叠(collapse)成激发态的3-氨基邻苯二甲酸([AP^2-]*)；[AP^2-]*然后返回到基态(AP^2-)而发射425nm的光子(hν)：

L+H₂O₂→LO₂^2-→[AP^2-]*+N₂→AP^2-+hν (6)