[发明专利]一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法，本发明通过阻断甾醇酯途径(ΔARE1、ΔARE2)、三酰基甘油途径(ΔDGA1、ΔLRO1)和β氧化途径(ΔPXA2)富集脂肪酰辅酶A作为生产脂肪酸乙酯的前体物质，在此基础上整合表达根据酿酒酵母密码子优化的外源基因WS2(蜡酯合成酶)构建一条可以利用葡萄糖为底物，经过一系列反应形成脂肪酸乙酯的代谢通路，并提供一种适用于所构建的酿酒酵母工程菌的发酵方法，酿酒酵母工程菌的FAEE最高产量为1.35g/L，是目前报道的利用酿酒酵母产FAEE产量中较高的。

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，尤其涉及一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法。

背景技术

脂肪酸乙酯是柴油的前体物质，现阶段对于通过细胞工厂生产FAEE的研究并不是很多，更多的集中在利用化学合成生产FAEE作为柴油的前体物质，不过化学合成高效率的背后却对环境和原料损耗方面有着极大的负担，因此从长远角度考虑，利用细胞工厂生产脂肪酸乙酯(FAEE)更顺应时代潮流。目前已有尝试在大肠杆菌E.coli、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、产油酵母Yarrowia lipolytica等微生物体内通过代谢途径改造生产FAEE。

酿酒酵母是一种适合微生物大规模长期培养的候选菌，被认为是最具潜力的大规模生产菌种。酿酒酵母生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养等优点，一直是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛。酿酒酵母也被用于其他具有重要工业价值代谢产物的发酵。但是，在酿酒酵母中单纯通过基因敲除阻断分支途径以及异源表达WS2等手段获得的FAEE最高产量为34mg/L，还不能够适用于工业生产。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法，通过阻断甾醇酯途径(ΔARE1、ΔARE2)、三酰基甘油途径(ΔDGA1、ΔLRO1)和β氧化途径(ΔPXA2)富集脂肪酰辅酶A作为生产脂肪酸乙酯的前体物质，在此基础上整合表达根据酿酒酵母密码子优化的外源基因WS2(蜡酯合成酶)构建一条可以利用葡萄糖为底物，反应形成脂肪酸乙酯的代谢通路，并提供一种适用于所构建的酿酒酵母工程菌的发酵方法，酿酒酵母工程菌的FAEE最高产量为1.35g/L，是目前报道的利用酿酒酵母产FAEE产量中较高的。

本发明的第一个目的是提供一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法，包括如下步骤：

在酿酒酵母宿主中，阻断甾醇酯途径、三酰基甘油途径和β氧化途径，并表达了蜡酯合成酶，构建得到产脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌；

在所述的酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，发酵30～40h时一次性补加1～3％菜籽油并且开始按照6～10mL/h的流速流加乙醇；并在发酵罐中葡萄糖浓度低于4～6g/L后，开始补加葡萄糖，将发酵罐葡萄糖浓度维持在5～10g/L，进行发酵培养，得到含有脂肪酸乙酯的发酵液。

进一步地，阻断甾醇酯途径是通过敲除甾醇酰基转移酶ARE1和ARE2的编码基因。

进一步地，阻断三酰基甘油途径是通过敲除甘油酰基转移酶DGA1和LRO1的编码基因。

进一步地，阻断β氧化途径是通过敲除长链脂肪酸转运体PXA2的编码基因。

进一步地，所述的蜡酯合成酶WS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在发酵培养过程中，pH维持在5～6，发酵前30～40h转速为180～220rpm，空气流量2～3vvm，30～40h后转速为350～450rpm，空气流量4～6vvm。

进一步地，在发酵培养之前，将所述的酿酒酵母工程菌活化后在种子培养基中培养得到种子液，再将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。

进一步地，所述的种子培养基为(g/L)：酵母粉5～15，蛋白胨15～25，葡萄糖15～25。