[发明专利]一种筛选内源性抗蛇毒抑制剂的亲和层析方法

权利要求书

1.一种毒素蛋白亲和层析介质，其特征在于，所述毒素蛋白亲和层析介质由基质表面N-羟基琥珀酰亚氨与蛇毒蛋白共价结合而成。

2.如权利要求1所述的毒素蛋白亲和层析介质，其特征在于，所述基质材料为NHS琼脂糖凝胶介质。

3.一种包含如权利要求1-2任一项所述的毒素蛋白亲和层析介质的亲和层析柱。

4.如权利要求3所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)称取100mg五步蛇毒溶于10mL碳酸氢钠溶液中，用0.45μm滤膜过滤；

(2)取5mL NHS活化琼脂糖凝胶，用20mL盐酸洗涤，再用碳酸氢钠溶液平衡凝胶柱，将蛇毒溶液与凝胶于室温翻转混合1小时或4℃过夜结合；

(3)用至少5倍柱体积的碳酸氢钠溶液平衡凝胶柱，收集穿透液，再用乙醇胺充分洗柱以封闭胶上的未偶联的活化位点。

5.如权利要求4所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，

所述碳酸氢钠溶液浓度为0.2M，pH 8.3；

所述盐酸浓度为1mM；

所述步骤(3)中的乙醇胺为10mM。

6.如权利要求4所述的亲和层析柱的制备方法，其特征在于，所述毒素蛋白为5-15mg/mL，NHS活化琼脂糖凝胶和毒素蛋白的体积比为1:0.5-1:2.0；所述步骤(1)所述反应在弱碱性环境中进行；毒素蛋白溶解的温度为4℃，时间为10-12h,或室温反应2-3h。

7.如权利要求3所述的亲和层析柱的应用，其特征在于，所述亲和层析柱用于分离出华游蛇样品中的抗毒素蛋白。

8.如权利要求7所述的亲和层析柱的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a样品处理：断头取新鲜华游蛇血液或提取的肝组织蛋白样品10mL，3000rpm，低温离心30min，获取上清，用PBS稀释2倍后，经0.45μm滤膜过滤，留取部分样品用于后续分析使用；

b平衡柱子：以流速为1mL/min PBS缓冲液平衡亲和层析柱，冲洗5个柱体积以上至基线平稳；

c上样：经蠕动泵，以0.5mL/min的流速将上述样品上样，重复上样2-3次或4℃孵育8h；用PBS缓冲液平衡柱子，以洗去未与填料柱结合的蛋白，至基线平稳，期间收集穿透液用于电泳检测；

d洗脱：用1M甘氨酸-盐酸缓冲液对结合在亲和层析柱上的蛋白进行洗脱，流速为2mL/min，体积为25mL；在吸光值为280nm下检测蛋白，收集洗脱峰。

9.如权利要求7或8所述的亲和层析柱的应用，其特征在于，所述华游蛇血清和肝匀浆液中的抗毒素蛋白的成分包括：磷脂酶A2抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、小血清蛋白。