[发明专利]核酸极短PCR扩增的方法、检测方法及应用

权利要求书

1.一种核酸检测的方法，所述核酸检测的方法为非疾病的诊断和治疗目的，

其特征在于，包括以下步骤：

S0、一种核酸极短PCR扩增的方法，使用引物对及用于扩增的模板分子，通过PCR扩增从样品中核酸分子制造含有特定碱基序列的扩增产物；

其中，所述引物对包括pg引物和ph引物，所述pg引物为长度小于等于14nt且5’端经磷酸基团修饰的单链DNA分子,所述引物对是根据目的基因的单核苷酸多态性位点而设计，所述pg引物和所述ph引物长度均在11nt~14nt之间，所述pg引物和所述ph引物的Tm值均小于40℃；所述模板分子为单链DNA分子和双链DNA分子中的至少一种；扩增条件为70 ℃ 1s、40℃ 1s，30~50个循环；

S1、利用上述核酸极短PCR扩增的方法扩增目标样品，得到长度大于15nt的核酸扩增产物；

S2、在含有PfAgo酶和分子信标的反应体系中，利用所述核酸扩增产物介导PfAgo酶切割分子信标，检测切割过程中产生的荧光信号，以获取所述目标样品中核酸分子的荧光值；

S2步骤中，所述pg引物与所述分子信标互补。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2步骤在如下反应体系下进行：

PfAgo酶，2 µl，

分子信标，1 µl，

10×PfAgo反应缓冲液，1 µl，

所述S1步骤扩增产物，5 µl，

加ddH₂O至10µl；

反应条件为：95 ℃、30min；

其中，10×PfAgo反应缓冲液配方为：20 mM HEPES (pH7.5)、250 mM NaCl和0.5 mMMnCl₂。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，目标核酸分子能够为单链DNA分子ssDNA，来自SARS-CoV-2的单链DNA分子ssDNA-OS2，来自MERS的单链DNA分子ssDNA-OM，来自SARS-CoV的单链DNA分子ssDNA-OS，来自SARS-CoV-2的单核苷酸多态性位点的单链DNA分子nt8782C、nt8782T、nt28144T和nt28144C，来自VP72基因的VP72分子和来自HPV16的L1基因的DNA分子中的至少一种；

其中，ssDNA1、ssDNA-OS2、ssDNA-OM、ssDNA-OS、nt8782C、nt8782T，nt28144T、nt28144C、VP72和L1对应的序列依次为：

ssDNA1：

5’-AGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-3’，如SEQ IDNO.1所示；

ssDNA-OS2：

5’-ACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

ssDNA-OM：

5’-AGCAGCACTGCCCCAATCTAAAGATTCCAAT-3’，如SEQ ID NO.3所示；

ssDNA-OS：

5’-ACCCTTGATGCAGTCTGCGGATGCATCAACG-3’，如SEQ ID NO.4所示；

nt8782C：

5’-ACTACCACCACGCTGGCTAAACCATGTGTCA-3’，如SEQ ID NO.5所示；

nt8782T：

5’-ACTACCACCACGCTGACTAAACCATGTGTCA-3’，如SEQ ID NO.6所示；

nt28144T：

5’-GCAATTAATTGTAAAAGGTAAACAGGAAACTGTAT-3’，如SEQ ID NO.7所示；

nt28144C：

5’-GCAATTAATTGTAAAAGGTGAACAGGAAACTGTAT-3’，如SEQ ID NO.8所示；

VP72：

5’-CTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACC-3’，如SEQ ID NO.9所示；

L1：

5’-AAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATAC-3’，如SEQ ID NO.10所示。