[发明专利]一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物组合、试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物、试剂盒及检测方法。所述的引物组合包括以下核苷酸序列：检测Shigella boydiistr 80的引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条核苷酸序列组成；检测Shigella boydiistrATCC9210的引物对由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条核苷酸序列组成；所述的引物组合中SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:4的浓度比为1:1:1:1。本发明提供的引物组合能准确检测出上述两种志贺菌株，所述检测方法具有特异性强、准确性好、操作简便、成本低的优点。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物组合、试剂盒及检测方法。

背景技术

细菌性痢疾是我国多发肠道传染病之一，全年均可发生，以夏秋季多见，主要由志贺菌属(Shigella)引起。在伯杰手册(1984)中，志贺菌属分为4个群(种)：(1)A群：又称痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)，通称志贺氏痢疾杆菌。有12个血清型，其中8型又分为三个亚型。是惟一不能发酵甘露醇的一群志贺菌。(2)B群：又称福氏志贺菌(Shigellaflexneri)，通称福氏痢疾杆菌。发酵甘露醇。有15个血清型(含亚型及变种)，抗原构造复杂，各型间有交叉反应。(3)C群：又称鲍氏志贺菌(Shigellaboydii)，通称鲍氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，有18个血清型，各型间无交叉反应。(4)D群：即宋内志贺菌(Shigellasonnei)。抗原单一，只有一个血清型。是惟一具有鸟氨酸脱羧酶的一群志贺菌，宋内志贺菌有I相和II相两个交叉变异相。I相呈S型菌落，对小鼠有致病力，多自急性期感染病人标本中分离得。II相为R型菌落，对小鼠不致病，常从慢性患者或带菌者检出。

由于志贺菌在感染者的粪便中大量存在，也可能出现于健康携带者的粪便中，易污染食品和水源，可通过土壤、水源及其他媒介在人与人之间、人与动物之间相互传播引起感染或者发病，人群普遍易感，严重影响人类健康。因此，快速检测粪便及其他样品中该类病原菌，对预防、控制疾病的发生和流行至关重要。但常规检测这类致病菌需分离培养、生化和血清学鉴定等多个步骤，操作复杂，周期长(3-7天)，不利于卫生检疫、食品安全的检测监管，迫切需要开发快速、灵敏和特异的快速检测技术。

国内外针对快速检测技术的研究主要包括以下几个方面：(1)检测细菌某些专有的酶或产生的毒素的技术；(2)以检测细菌生化反应为基础的细菌自动鉴定系统；(3)检测细菌所特有的抗原的技术，通过抗原-抗体特异性反应来检测相应的病原菌，例如ELISA、胶体金技术等；(4)检测细菌的核酸：如核酸杂交、PCR(聚合酶链式反应)、基因芯片、脉冲场电泳分型技术等。

虽然这些技术或系统与常规检验方法相比，能够在较短时间内鉴定病原菌，但仍存在局限性：(1)这些技术和系统大多需要细菌的纯培养物进行鉴定，而得到细菌纯培养物，一般需要经过非选择性和/或选择性增菌培养、平板分离、纯培养这几个步骤，需要1-4天时间，仍然不能充分满足病原菌快速检测的需要；(2)某些技术或系统成本高，如全自动微生物分析系统、脉冲场电泳仪、细菌检测芯片系统等，虽然能够较快速和多目标检测，但仪器设备和运行费用昂贵，不利于推广，尽管已有研究致力于降低仪器设备和运行费用，如纳米可视芯片的开发，但实验时间和反应的信噪比有待进一步改善；(3)缺乏能分离富集多种目的菌的样品前处理技术。

中国专利CN102329861A公开了一种福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增。其中是根据gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX、wzx_1-5和gtrIC基因，设计提供了一套(8对)特定性、退火温度一致的引物对待测样品进行多重扩增，定性检测福氏志贺菌血清型。然而，该多重扩增方法并不能区分Xv与X血清型。该专利在区分Xv与X血清型时，仍需进一步采用传统的IV抗血清拨片凝集反应，而玻片凝集法费时，所用抗血清试剂昂贵，且通过目测判断结果会导致错误的结果。此外，该专利公开的方法也不能有效区分Yv与Y血清型、以及4a与4av血清型。