[发明专利]BeSO4

权利要求书

1.BeSO₄染毒大鼠血清差异表达蛋白检测与分析方法，其特征是：步骤如下：

S01、获取大鼠血清：

a、选10只健康的雄性大鼠，随机分为5只一组的对照组和5只一组的染毒组，分别正常喂水喂食饲养6周，染毒组在第2周滴注0.25ml的BeSO₄溶液到大鼠气管中，对照组在第2周滴注0.25ml的灭菌超纯水到大鼠气管中；

b、染毒组和对照组共10只大鼠均用乙醚麻醉，再用腹主动脉采血法分别收集血液于10个真空采血管中；

c、将10个真空采血管静置30min，然后对10个真空采血管进行离心处理，使血清和血细胞分层，离心完成后，分别吸取10个真空采血管内的上层血清待用，共得到10份血清；

S02、样品制备：

a、每份血清取60ul，分别加入540ul结合缓冲液，得到10份600ul的稀释血清样本；

b、准备10个分离柱和10个收集管A，将10个分离柱除去上盖后分别放入10个收集管A内，通过分离柱的上端开口向分离柱内部加入0.85ml的结合缓冲液，以激活分离柱内部的吸附材料；

c、将600ul的稀释血清样本加入分离柱内，再向分离柱内加入600ul的结合缓冲液，使稀释血清样本中除了高丰度蛋白之外的蛋白全部被吸附在分离柱内部的吸附材料上，稀释血清样本中的高丰度蛋白从分离柱下端排出并进入收集管A内；

d、准备10个收集管B，使用清洗剂冲洗分离柱内部的吸附材料，将除高丰度蛋白之外的其他蛋白冲刷下来，收集到收集管B中；

e、准备10个超滤管，分别测定10个收集管B中溶液的蛋白质浓度，根据每份溶液的蛋白质浓度，在10份溶液中分别取含有150ug蛋白质的溶液量，转移到各超滤管的内管中；

S03、蛋白还原处理：

a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为10mM的DTT溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul，再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃各超滤管外管中的滤出液；

b、重复b分步骤至少两次，使清洗剂被DTT充分置换掉；

c、将10个超滤管静置1h，使超滤管内管中的蛋白质与DTT充分发生还原反应；

S04、蛋白烷基化处理：

a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为20mM的IAA溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；

b、重复a步骤至少两次，使DTT被IAA充分置换掉；

c、将10个超滤管静置于37℃的孵育箱中避光静置1h，使超滤管内管中的蛋白质与IAA充分发生烷基化反应；

S05、蛋白酶解：

a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为100mM的TEAB溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；

b、重复a步骤至少两次，使IAA被TEAB充分置换掉；

c、准备10个收集管C，将10个超滤管内管中的溶液一一对应的转移至10个收集管C中，分别添加胰蛋白酶至各收集管C中，各收集管C均于37℃的温度下进行酶解反应14-16h；

S06、对蛋白进行TMT标记：

使用TMT标签对酶解后的10个收集管C中的样品进行标记，每管样品使用一个标签，各收集管C均置于37℃的孵育箱中进行标记反应1h，标记反应完成后，各收集管C中分别加入8ul的5%质量浓度的羟胺溶液，静置15min，以终止标记反应；

S07、对样品进行LC-MS/MS检测：

a、将染毒组的5管样品混合为一管，命名为A管，将对照组的5管样品混合为一管，命名为B管，再分别对A管和B管内的溶液进行浓缩干燥，然后在A管和B管内分别加入200ul的0.1%FA溶解干燥浓缩后的样品，之后对A管和B管内的溶液分别进行分组分，各获得45管分馏样品，将所有的分馏样品浓缩蒸干以待后续试验使用；

b、将染毒组的45管浓缩蒸干样品分别命名为C₁、C₂、C₃·····C₄₅，在C₁- C₁₅号浓缩蒸干样品中分别加入20ul的0.1%FA进行溶解，然后用C₁号溶液依次溶解C₁₆号和C₃₁号样品，用C₂号溶液依次溶解C₁₇号和C₃₂号样品，用C₃号溶液依次溶解C₁₈号和C₃₃号样品，以此类推，用C₁₅溶液依次溶解C₃₀号和C₄₅号样品，最终得到15管染毒组的溶液，每管溶液中均包含3管浓缩蒸干样品的物质量；

c、将对照组的45管浓缩蒸干样品分别命名为D₁、D₂、D₃·····D₄₅，在D₁- D₁₅号浓缩蒸干样品中分别加入20ul的0.1%FA进行溶解，然后用D₁号溶液依次溶解D₁₆号和D₃₁号样品，用C₂号溶液依次溶解D₁₇号和C₃₂号样品，用D₃号溶液依次溶解D₁₈号和D₃₃号样品，以此类推，用D₁₅溶液依次溶解D₃₀号和D₄₅号样品，最终得到15管对照组的溶液，每管溶液中均包含3管浓缩蒸干样品的物质量；

d、将染毒组和对照组共30管溶液于质谱仪进行上机检测，针对检测数据使用UniProt人数据库进行搜索，获得包含蛋白种类、丰度信息和相对分子量的原始数据；

S08、GO和KEGG富集分析：

a、按照P value＜0.05、|FC|1.2的标准，通过Persue软件对原始数据进行筛选，找到差异表达蛋白；

b、基于R语言“clusterProfiler”及“org.Hs.eg.db”两个软件包对差异表达蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析，通过GO富集分析获取差异表达蛋白的生物学功能、分布位置和分子功能，通过KEGG富集分析获取差异表达蛋白参与BeSO₄染毒大鼠血清的信号途径；

c、从KEGG富集分析得到的多种信号途径中，选出与BeSO₄染毒大鼠血清相关的信号途径，结合该信号途径对应的通路图，从差异表达蛋白中筛选出参与了该信号途径的蛋白；

S09、PPI网络图分析：

a、将参与了信号途径的蛋白输入String在线数据库进行检索，将检索结果保存为TSV格式文件；

b、通过Cytoscape软件对TSV格式文件进行可视化分析，绘制出PPI网络图；

c、结合PPI网络图，从参与了信号途径的蛋白中筛选出关键蛋白，所述关键蛋白同时与至少2种蛋白具有相关性。