[发明专利]一种异亮氨酰tRNA合成酶与雷弗霉素A的复合物晶体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种异亮氨酰tRNA合成酶与雷弗霉素A的复合物晶体及其制备方法和应用。该复合物晶体揭示小分子抑制剂雷弗霉素A(RM‑A)占据异亮氨酰tRNA合成酶(IleRS)催化结构域上底物tRNA的结合位点，而且反应中间体异亮氨酰单磷酸腺苷(Ile‑AMP)可与RM‑A协同结合到催化结构域中，占据了催化结构域上底物氨基酸和底物ATP的结合位点。另外本发明利用坐滴气相扩散法进行复合物晶体培养。本发明有利于进行基于结构的RM‑A衍生物设计，发展RM‑A与氨基酸位点和/或ATP位点抑制剂的联合使用策略，以及应用于其它I型AARS抑制剂的设计。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种三元复合物晶体及其制备方法和应用。

背景技术

聚酮天然产物雷氟霉素A(reveromycin A；缩写：RM-A)最初是在1991年由日本理化研究所(RIKEN)在一次抗癌化合物筛选研究中从链霉菌SN-593中分离得到的。RM-A能抑制人肿瘤细胞(KB和K562等)的体外增殖，以及限制卵巢癌和前列腺癌在动物体内的发展。后续的研究发现，RM-A能高效地诱导破骨细胞的凋亡，并能抑制去卵巢小鼠的骨丢失，因此其具有发展成为新型抗骨质疏松药物的潜力。RM-A对破骨细胞的毒性高于对其它细胞(如破骨细胞祖细胞)至少100倍以上。RM-A结构中含有三个羧酸基团，在中性环境中容易发生电离呈负电性，使得RM-A难以透过细胞膜。破骨细胞分泌酸溶骨，形成酸性微环境，能抑制羧酸电离，显著提高了RM-A的透膜能力，从而展现出对破骨细胞特异性的高抑制活性。出于同样的原因，RM-A还表现出抑制癌症骨转移及抗牙周病的潜力。此外，在酸性条件下，RM-A对其它细胞和真菌也表现出很强的毒性，如在pH为3.0时对白色念珠菌的最小抑制浓度(MIC)值为3μM的。通过对具有RM-A抗性的酿酒酵母进行基因测序，RM-A的分子靶点被确定为真核生物的细胞质异亮氨酰tRNA合成酶(isoleucyl-tRNA synthetase；缩写：IleRS)。

IleRS属于氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase；缩写：AARS)家族成员之一。细胞生命体通常含有20种的AARS，与合成蛋白质的20种氨基酸一一对应。AARS通过两步反应将氨基酸连接到相应tRNA的CCA接受臂：首先，氨基酸和ATP结合到催化结构域，生成氨酰化单磷酸腺苷(aminoacyl-adenylate)，然后氨酰基从该中间体氨酰化单磷酸腺苷转移到tRNA的CCA接受臂生成氨酰化tRNA(aminoacyl-tRNA)。氨酰化tRNA会被运输到核糖体参与蛋白质翻译。根据催化口袋的结构特征，AARS可分成两类，各含有十个成员。其中，IleRS属于I型AARS，以罗斯曼折(Rossmann fold)构成催化结构域。由于AARS在蛋白质翻译中发挥着不可或缺的功能，AARS是治疗多种人类疾病的有效靶点。传统的AARS 抑制剂主要针对氨基酸和/或ATP结合位点。例如，莫匹罗星(mupirocin)作为一种细菌型 IleRS的氨基酸和ATP双位点抑制剂，已被广泛应用于皮肤局部细菌感染的治疗(Silvian,L.F., etal.Science 285,1074-1077(1999))。新型AARS抑制剂AN2690靶向于亮氨酰tRNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase,LeuRS)的校正结构域，已被FDA批准用于治疗甲藓(Rock,F.L.et al. Science 316,1759-1761(2007))。

RM-A具有一个6,6-螺酮缩醇核心，两条带末端羧基的不饱和侧链，一条半琥珀酸酯链及两条烷基侧链，其结构与AARS的底物(氨基酸，ATP及tRNA)及目前发现的抑制剂结构均有很大差别。尽管RM-A对真核生物的细胞质IleRS具有很高的抑制活性，半数抑制浓度(IC₅₀)可达到2-10nM，但因为其独特的结构特征，其抑制IleRS的作用机制尚不清楚，很大程度上限制了基于RM-A的药物发展。

因此，开发基于RM-A的AARS靶向药物的发展具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容