[发明专利]一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用，所述栖热腔菌磷酸酶突变体由来源于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型磷酸酶经突变所得，所述突变为以下一种：N212G或N212D。本发明栖热腔菌磷酸酶突变体对氨基葡萄糖‑6‑磷酸具有较高的催化活力(最高达1.64U/mg)，相对于其他磷酸单糖(葡萄糖‑6‑磷酸，葡萄糖‑1‑磷酸，果糖‑6‑磷酸)的酶活力提升不显著或者下降，从而其对氨基葡萄糖‑6‑磷酸的底物专一性较其亲本磷酸酶有了较大的提升。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种栖热腔菌磷酸酶突变体及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖又名葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)，通常以N-乙酰基衍生物(如甲壳素)等形式广泛存在于微生物、动物来源的多糖和结合多糖中，是糖蛋白及蛋白聚糖的重要组成成分。作为一种重要的功能性单糖，氨基葡萄糖在食品、医疗保健、化妆品等多个领域具有广泛用途。随着骨关节炎病人数量的不断增加，硫酸氨基葡萄糖作为首个高效减缓骨关节炎病况的特异性药物，尤其在刺激软骨细胞的生长，抑制关节软骨的分解，促进软骨组织修复等方面具有重要的治疗效果。此外，氨基葡萄糖硫酸盐还能够抑制白血病细胞增殖，并有消炎护肝，抗氧化抗衰老等功效。在欧美国家，氨基葡萄糖被作为食品及保健品的配料。随着全球老龄化加剧，氨基葡萄糖需求不断增加，据调查数据显示，2018年氨基葡萄糖国内销售市场规模约40亿元，可见其发展前景好，市场潜力大。

目前氨基葡萄糖的合成路线主要包括甲壳素水解法及微生物发酵法两种方式。甲壳素水解法包括甲壳素酸水解和甲壳素酶水解法，虽简单快速，但环境污染严重，原料供应受到地域限制，且会引起过敏体质患者的过敏反应。甲壳素酶解法利用壳聚糖酶对虾蟹壳进行降解，现在面临的最大问题是生产效率低下，表现为壳聚糖酶价格较高、转化时间较长及生产成本较高。而且，来源于虾蟹壳的氨基葡萄糖在临床应用过程中会引起过敏体质患者的过敏反应。微生物发酵法具有污染小、生产强度高、成本较低、条件温和、无过敏反应的优点，但反应产物N-乙酰基葡萄糖氨需要进一步通过去乙酰化反应，导致分离纯化产品过程复杂、原子经济性能不高等局限。

近期游醇等公开了一种利用体外多酶反应体系合成氨基葡萄糖的新合成方法(CN201810772487.3)，该方法利用淀粉或淀粉衍生物等廉价碳源为底物，设计了能够利用无机胺盐实现氨基葡萄糖的合成路径，通过构建多酶反应体系催化生产氨基葡萄糖，该方法具有原料廉价、来源丰富、生产成本低、环境友好、对人体安全等优点。但在该合成路线中，由于同时存在多个磷酸单糖，若磷酸酶对氨基葡萄糖-6-磷酸水解活力不高，底物选择性差，则在此多酶反应系统中，会造成反应中间体(如葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸)磷酸键水解，从而导致副产物如葡萄糖、果糖等的累积，影响目的产物氨基葡萄糖的得率。因此，获得一种对氨基葡萄糖-6-磷酸的磷酸水解活力且专一性较高的磷酸酶是提高目的产物得率的关键。天然酶库中，嗜热菌来源的磷酸酶热稳定较高，适合长时期多批次的连续反应操作，更具有工业应用潜力。但目前嗜热型磷酸酶底物谱广，对氨基葡萄糖-6-磷酸水解活性普遍较低，无法实现氨基葡萄糖的定向合成。故在此背景下，本发明通过分子改造技术获得对底物氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸键水解特异性和酶活提高的嗜热菌来源的磷酸酶突变体，可应用于氨基葡萄糖的催化合成。本发明对减少副产物，提高氨基葡萄糖的产率具有重要意义。

发明内容

本发明目的是在于对栖热腔菌属(unclassified Thermosipho(in：Bacteria))磷酸酶(ThGlmP)进行分子改造，获得对磷酸键水解反应底物氨基葡萄糖-6-磷酸的酶活力及专一性较高的突变体，利用该磷酸酶突变体可应用于氨基葡萄糖的催化合成。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：