[发明专利]一种非天然核酸水凝胶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种非天然核酸水凝胶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）上下游“毛刷”引物的制备：

a. 在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙胺基修饰的人工核苷酸5-propargylamino-dCTP，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸片段；所述的聚合酶链式反应体系中的聚合酶为Taq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、Q5 DNA聚合酶或SFM4-3中的任意一种；

b. 将步骤a所得核酸片段与点击化学接头反应，在核酸片段部分核苷酸上修饰接头；

c. 根据目的片段的序列设计并合成上、下游引物，并将上、下游引物5'端修饰能与接头发生点击化学反应的叠氮基团；

d. 将步骤b所得部分核苷酸上含接头的核酸片段，分别与步骤c所得5'端含修饰叠氮基团的上、下游引物进行点击化学反应，得到上、下游“毛刷”引物；

（2）非天然核酸水凝胶的制备：

以含有目的片段的核酸片段或质粒为模板，通过步骤（1）所得上、下游“毛刷”引物进行PCR扩增，扩增产物浓缩后高温退火，即得到所述的非天然核酸水凝胶；所述的PCR扩增的体系中含有0.8～1.2 mol/L NaCl、0.04～0.06% Tween20。

2.根据权利要求1所述的非天然核酸水凝胶的制备方法，其特征在于：

当所述的聚合酶为SFM4-3时，在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙胺基修饰的人工核苷酸时，在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、糖基部分的2号位点上含氟基团修饰的人工核苷酸，制备得到碱基上含氨基修饰同时糖基上含氟基团修饰的核酸片段，再进行后续反应；

和/或，在聚合酶链式反应体系中掺入非天然碱基dTPT3和dNaM，制备得到含非天然碱基对的核酸片段，再进行后续反应；

聚合酶链式反应体系中的核苷酸是脱氧核糖核苷酸混合物，或核糖核苷酸混合物，或脱氧核糖核苷酸/核糖核苷酸混合物。

3.根据权利要求1所述的非天然核酸水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤b中所述的点击化学接头选自NHS-DBCO接头或NHS-TCO接头。

4.根据权利要求1所述的非天然核酸水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤a中所述的掺入的方式是完全替代或部分替代天然核苷酸中的一种或多种；

步骤a中所述的核酸片段的长度为50～100 bp。

5.根据权利要求1所述的非天然核酸水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤b中所述的核酸片段与点击化学接头的配比为摩尔比1:1000～1500；

步骤b中所述的反应的条件为温度35～40℃、时间10～15h；

步骤b中所述的反应在pH=8.4～8.6的PBS缓冲液体系中进行。

6.根据权利要求1所述的非天然核酸水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤d中所述的核酸片段与上下游引物的配比为摩尔比为8～12:1；

步骤d中所述的反应的条件为温度45～55℃、时间10～15 h；

步骤d中所述的反应在pH=7.3～7.5的PBS缓冲液体系中进行。

7.根据权利要求1所述的非天然核酸水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的浓缩的条件如下：5000～7000 rpm转速下离心25～35 min；

步骤（2）中所述的高温退火的操作如下：在95℃加热5min后逐渐冷却至室温。

8.一种非天然核酸水凝胶，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的方法制备得到。

9.权利要求8所述的非天然核酸水凝胶在制备药物载体中的应用。