[发明专利]一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒及其制备方法和检测方法

说明书

本发明属于食品检测领域，具体公开了一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒及其制备方法和检测方法。所述试剂盒包括CRISPR‑Cas检测体系，具体包括：分子识别剂；信号转换剂；转录体系；以及缓冲液。本发明设计了一种CRISPR‑Cas 13直接切割RNA序列以检测单增李斯特菌的方法，利用Cas 13蛋白与crRNA锚定序列结合形成识别元件crRNA‑Cas13复合物，靶标RNA存在时，其与crRNA向导序列结合，激活Cas13的非特异性RNase活性，剪切信号分子，产生荧光淬灭。本发明通过检测目标细菌RNA而非DNA，实现对单增李斯特菌的检测，可避免检测结果出现假阳性造成实际菌落检出数偏高；该方法一步即可直接检测目标RNA，无需进行PCR扩增，简化了操作流程，且可避免非特异性扩增和交叉污染的问题。

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes），简称单增李斯特菌，是一种食源性病原体，在发展中国家和发达国家都对人类健康造成了重大威胁。单增李斯特菌感染可导致败血症，脑膜炎，肠胃炎和流产。这种病原体可以在土壤，水，植物和人或动物的粪便中生存，而且在冷藏温度下仍能保持生存和增长，这对食物的储存构成了巨大威胁。为了有效防止单增李斯特菌的危害，迫切需要一种高度特异性、快速、准确的食品中检测方法。

食品和环境样品中单增李斯特菌的检测方法首先需要培养富集，然后是传统的生化培养法培养、免疫学法或以聚合酶链式反应(PCR)为基础的分子生物学方法。例如，CN105527441 A公开了一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法,以2G7为包被抗体、2H8-HRP为酶标抗体建立夹心ELISA方法对单增李斯特菌进行特异性检测。CN 110184367 А公开了一种单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌多重PCR检测试剂盒，可对单增李斯特菌进行快速准确的检测。

然而免疫学法主要依靠蛋白质抗体，其生产方法复杂，保质期相对较短，靶标特异性和亲和力程度不同且成本高。而传统的PCR法无法区分活菌和死菌，从死菌中扩增DNA可能会导致检测结果高于实际菌落数，导致检测误差较大。由于RNA分子通常具有较短的半衰期，因此被认为比DNA更适合用于活力检测，一些基于RNA检测致病菌的方法或产品也已经得到研发并公开。例如，CN 111321234 A公开了一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用，通过PCR扩增及体外转录得到待测细菌目标RNA，目标RNA激活Cas13a-crRNA复合物的切割能力,切割两端修饰的荧光探针,导致荧光值增加,荧光值的增长与目标RNA浓度存在线性对应关系,利用此来检测微生物。但专利CN 111321234 A中基于CRISPR-Cas13a的检测方法需要在RNA的两端标记荧光基团和淬灭基团，检测成本昂贵，操作流程也较为繁琐，无法满足同时具有高效率、高灵敏度、强特异性和低成本的需求。

发明内容

鉴于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒及其制备方法和检测方法。

第一方面，本发明提供了一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒。

一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括CRISPR-Cas检测体系，具体包括：分子识别剂；信号转换剂；转录体系；以及缓冲液；

其中，所述分子识别剂包括：Cas蛋白和L-crRNA ，L-crRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述信号转换试剂包括L-Broccoli和荧光染料，L-Broccoli的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；所述转录体系包括启动子、phi29 DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、dNTPs、rNTPs、DNase I，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。