[发明专利]基于密度梯度离心提取细胞内体的方法

权利要求书

1.一种基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，所述方法包括：

将含有内体的细胞膜破坏获取去核后上清液，将去核后上清液缓慢添加至蔗糖梯度溶液液面，然后进行离心，离心结束后从管底自溶液密度由高至低收集分离液即可获得含有内体的溶液，所述蔗糖梯度溶液为含有不同浓度梯度的蔗糖溶液，所述蔗糖溶液的浓度范围为15％～40.6％；

所述蔗糖浓度梯度溶液的浓度梯度为连续浓度梯度，所述连续浓度梯度的配制方法为逐层冷冻再复融法，

所述逐层冷冻再复融法为分别配制10％～15％的低浓度溶液、35％～40％的高浓度溶液，按体积比2：1和1：2分别混合两种溶液，先加1体积高浓度溶液在管底，冷冻，然后加1体积的2：1的溶液冷冻，再加1体积的1：2的溶液冷冻，最后加1体积低浓度溶液冷冻，使用前复融，使其自然形成梯度，所述细胞为Jurkat细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞膜破坏获取去核后上清液的方法选自以下任一：

将细胞离心后，添加缓冲液，转移进匀浆器中研磨，然后倒出研磨好的液体离心获得去核后上清；或

将细胞离心后，添加缓冲液，用注射器吸取液体，反复吹吸，然后将液体离心获得去核后上清。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述研磨次数为10～30次。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述注射器为1ml注射器，针头大小为23～27G，吹吸次数为15～20次。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤a)或者步骤b)中离心条件为1600～2000g，8～12min，4℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述从管底自溶液密度由高至低收集分离液采用蠕动泵，蠕动泵流速为0.5～1ml/min。