[发明专利]筛选菌液表达dsRNA载体的方法

说明书

筛选菌液表达dsRNA载体的方法，它涉及一种筛选表达dsRNA载体的方法。针对RNAi的特异性以及原核发酵获得dsRNA良好的应用前景，本发明提供筛选菌液表达dsRNA载体的方法以及提高原核表达dsRNA表达量的方法。本发明方法：一、合成测试dsgfp片段；二、设计引物；三、测试dsgfp片段扩增；四、备选表达载体酶切后与扩增片段重组，质粒转入感受态细胞；五、IPTG诱导表达；六、体外合成的dsgfp DNA模板制备；七、取诱导菌液用备选dsRNA提取方法提取菌液中的dsgfp；八、根据测定结果从备选表达载体中确定最合适的表达载体及最佳dsRNA提取方法。

技术领域

本发明涉及一种筛选表达dsRNA载体的方法。

背景技术

据研究dsRNA在环境中极不稳定，自然条件下3～5小时就会完全降解；San等发现dsRNA在紫外线照射下4小时就会完全降解。并且其作用机制研究不系统，植物是否会传递、扩增dsRNA以及有害生物对RNAi敏感性差别大等因素，导致基于RNAi的应用技术迟迟未面世。目前，dsRNA主要通过三个方法实现大量生产：一、合成含有T7启动子的dsRNA特异性引物，运用体外合成试剂盒合成dsRNA。该方法可大量合成dsRNA，快速高效，合成dsRNA可直接使用，但体外合成试剂盒成本较高，实际大规模推广使用不切实际。二、原核生物发酵生产dsRNA，最早用于干扰秀丽引线虫，喂食秀丽引线虫时可产生强烈干扰。将构建完成的dsRNA表达载体导入RNase III缺陷型大肠杆菌HT115(DE3)感受态中，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，产生dsRNA。该方法可发酵得到大量dsRNA，且成本较低，在实际生活中可大规模推广使用。但在发酵、诱导过程中，如何保证菌体高活性、持续产生dsRNA，仍需有待研究。三、通过转基因植物表达dsRNA，使植物具有“终生”防御性，害虫啃食植物后，可有效抑制其生长发育甚至直接死亡，无需人为干预。该方法虽然可以一劳永逸，但转基因植物是否真的安全，是否会演变成“超级植物”从而影响生态系统平衡，仍需大量研究。

发明内容

针对RNAi的特异性以及原核发酵获得dsRNA良好的应用前景，本发明提供筛选菌液表达dsRNA载体的方法以及提高原核表达dsRNA表达量的方法。

本发明筛选菌液表达dsRNA载体的方法：

一、以gfp序列为模板，节选不同长度的dsgfp片段并随机改变序列的碱基，合成不同碱基CG含量的测试dsgfp片段；

二、以启动子为起始序列设计、合成体外合成引物；根据备选表达载体选择双酶切位点设计、合成dsgfp片段扩增引物；

三、以测试dsgfp片段为模板，用dsgfp片段扩增引物进行PCR扩增；

四、对备选表达载体进行双酶切然后与步骤三PCR扩增的dsgfp片段重组，再将重组产物加入Trans-T1感受态细胞培养，挑取单克隆进行验证和测序；验证正确的质粒转入HT115(DE3)感受态细胞；获得初始菌液；

五、IPTG诱导表达，获得诱导菌液；

六、体外合成的dsgfp DNA模板制备；

七、取诱导菌液采用备选dsRNA提取方法提取菌液中的dsgfp；

八、根据测定菌液的dsgfp浓度、纯度和产量结果从备选表达载体中确定最为合适的表达载体以及该表达载体对应的最佳dsRNA提取方法。

本发明提高原核表达dsRNA表达量的方法，其特征在于选用CG含量为25～35％的dsRNA进行表达。

进一步，选用CG含量为30％的dsRNA进行表达。

进一步，原核表达载体为L4440和pET-2p。

本发明方法可以从备选表达载体中确定最为合适的表达载体以及该表达载体对应的最佳dsRNA提取方法。