[发明专利]一种NK细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种NK细胞及其制备方法和应用。所述制备方法包括利用工程化K562细胞诱导培养脐带血单个核细胞，得到NK细胞。所述工程化K562细胞表达细胞因子CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L，能够高效扩增激活脐带血单个核细胞，所制备的NK细胞具有较高的扩增数量和细胞活力，且工程化K562细胞使用量低，能够有效降低成本。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种NK细胞及其制备方法和应用。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，是人体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线，可非特异性直接杀伤肿瘤细胞，还具有免疫调节功能，能够与机体其它多种免疫细胞相互作用，调节机体的免疫状态和免疫功能。临床研究发现NK细胞过继性免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景，对多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤均有一定效果。

现有的NK细胞扩增培养技术主要包括，因子法：抽取外周血或利用单细胞采集机并结合淋巴细胞分离液获得外周血单个核细胞(PBMC)，然后直接培养或分选PBMC中的NK细胞，在普通的淋巴细胞培养基中单独使用细胞因子或联合饲养层细胞扩增NK；抗体包被法：在抗体包被的培养瓶中用普通淋巴细胞培养基扩增培养PBMC或分选后的NK细胞；专用NK培养基：购买专用的NK培养基从PBMC中特异性扩增NK细胞或者对分选后的NK细胞进行扩增；干细胞诱导：将干细胞诱导分化成NK细胞，然后进行扩增。

CN105238754A公开了一种高增殖力和高杀伤力NK细胞的体外培养方法，所述方法包括使用抗人CD3单克隆抗体和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶扩增培养PBMC，获得NK细胞，无需使用滋养层细胞。但NK扩增数量、纯度及NK细胞活力上都难以满足临床需求。

CN104894072A提供了一种自体自然杀伤细胞增殖培养的制备方法，所述方法包括使用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2扩增激活来自于癌症患者自身的单个核细胞，获得自然杀伤细胞，自然杀伤细胞增殖倍数达到2500倍以上，具有很强杀伤毒性，但滋养层细胞的用量较大，成本较高。

综合上述，提供一种NK细胞制备方法，成本低，所制备的NK细胞具有较高的扩增数量和细胞活力，对于NK细胞制备领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种NK细胞及其制备方法和应用，所述制备方法利用工程化K562细胞诱导培养脐带血单个核细胞，能够高效制备NK细胞，所制备的NK细胞具有较高的扩增数量和细胞活力。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种NK细胞的制备方法，所述制备方法包括利用工程化K562细胞诱导培养脐带血单个核细胞，得到NK细胞。

本发明的制备方法中，工程化K562细胞能够高效扩增激活脐带血单个核细胞，所制备的NK细胞具有较高的扩增数量和细胞活力，且工程化K562细胞使用量低，能够有效降低成本。

优选地，所述工程化K562细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L。

优选地，所述IL-21通过与CD8α跨膜区融合表达在所述工程化K562细胞表面。

优选地，所述工程化K562细胞的基因组整合有CD19编码基因、CD86编码基因、IL21-CD8α编码基因、CD64编码基因和CD137L编码基因。

优选地，所述CD19编码基因包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

SEQ ID NO:1：