[发明专利]结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途

说明书

本发明属于河豚毒素检测技术领域，具体为一种结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途。本发明从TTX分子的结构出发，选有可能与TTX结合的核酸适配体Anti‑IFNγ；然后使用碱基A替换Anti‑IFNγ中的非天然碱基获得其变体AI‑57，并预测其3D结构；利用分子对接软件及分子动力学模拟软件模拟AI‑57与TTX的结合模式与结合过程,计算预测的平衡解离常数为26.0 nM；最后用微量热泳动实验验证AI‑57与TTX的结合能力,实验测得的平衡解离常数为28.3 nM，与计算值几乎一致。本发明确定的适配体AI‑57用于检测河豚毒素，对于食品安全具有极其重要的意义，为开发基于核酸适配体的TTX生物传感器奠定了基础。

技术领域

本发明属于河豚毒素检测技术领域，具体涉及结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其筛选方法和用途。

背景技术

河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) 是一种存在于河豚体内的海洋生物毒素，人类可能通过食用或接触受污染的海产品及生活用水而遭受TTX的侵害，该毒素会导致误食者腹泻性中毒以及麻痹性中毒；据报道，TTX的毒性约是氰化钠的100倍，摄入1~2 mg就足以杀死重50 kg的人体(1,6)。因此，检测海产品或生活用水中的TTX对于人类健康具有重要意义。目前，TTX的检测方法有小鼠生物检测法(MBA)(7)、酶联免疫分析法(ELISA)(8)、高效液相色谱法(HPLC)(9)以及液相色谱-质谱联用法(LC-MS)(10)等。然而，这些方法存在检测灵敏度低、操作复杂、重复性差、设备昂贵、对技术人员要求高或动物伦理等问题；同时，也没有足够快速的检测技术对水样或中毒生物进行TTX的现场检测(11)。因此，相关领域仍然需要快速、灵敏和低成本的检测方法。近年来，基于核酸适配体的生物传感器制作技术的快速发展，为高效检测TTX等海洋毒素提供了新的解决方案。

核酸适配体是一种由指数富集的配体系统进化技术 (Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment, SELEX)筛选出的寡核苷酸片段；可折叠成特定的结构，与靶标分子或细胞特异性结合；通常由20-80个核苷酸组成，分子量为6-30 kDa(12)。海洋毒素本身的毒性导致生物体难以产生抗体，因此，使用抗体检测毒素的方法也难以实现；而靶标小分子的核酸适配体可特异性识别或区分小分子间微小的差异，因此，通常作为化学和生物传感器的识别元件，广泛应用于食品和环境监测等领域(13)。生物传感器是一种以细胞分子或其他生物材料作为敏感元件，结合二级传感器，通过级联放大信号对多种化学物质进行检测的新型检测技术；具有操作简单、速度快、灵敏度高、小型化、易于自动化等优点；广泛应用于药物筛选、物质安全检测、疾病诊断等不同领域(14,15)。将核酸适配体作为生物传感器的敏感元件，不仅可以降低检测成本、缩短检测时间，而且可以提高检测灵敏度(15)。

综上，核酸适配体在TTX检测以及抑制剂制备等领域具有广阔的应用前景。然而，缺乏高亲和性TTX适配体的研究现状极大限制了其实际的应用。一方面是受到核酸适配体筛选方法的限制，如SELEX筛选方法存在操作复杂、周期长、样品消耗量大等问题；另一方面，因为适配体与小分子相互作用机制的研究尚不成熟，所以新发展的SELEX技术对TTX这种小分子筛选效率仍然很低，从而导致目前高亲和性TTX适配体极少。

因此，本发明得到的高亲和性TTX适配体AI-57，为开发基于适配体的生物传感器检测技术与解毒剂药物奠定基础，促进TTX适配体在各领域的发展与应用。此TTX核酸适配体的产生可分为两个部分，第一部分采用计算技术模拟核酸适配体AI-57与TTX分子的结合，第二部分通过实验验证该适配体能高亲和性结合TTX分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途，为开发基于适配体的生物传感器检测技术与解毒剂药物奠定基础。