[发明专利]一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法

说明书

本发明提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法，涉及分子生物技术领域。本发明所述引物对基于哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的mtDNA COI基因201bp序列差异设计，包括CSF和CSR，其中CSF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CSR的核苷酸序列如SEQ I D NO.2所示，其结果稳定，可重复性强。利用本发明所述引物对、试剂盒和鉴别方法，有助于解决海洋鱼类寄生虫种类混杂等问题，为重要经济鱼类养殖、病害防控和资源保护、合理利用以及生物多样性研究提供技术支撑。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

哈氏本尼登虫(Benedenia hoshinai)与鰤本尼登虫(Benedenia seriolae)均隶属于扁形动物门(Platyhelminthes)、单殖吸虫纲(Monogenoidea)、分室目(Capsalidea)，分室科(Capsalidae)，本尼登虫属(Benedenia)，是世界海水渔业养殖的高发病原生物，具有感染率高、周期短、破坏性强、传播广泛等特点。本尼登虫病俗称“白斑病”，虫体寄生后将对宿主产生不利影响：1)造成宿主行为异常，局部组织破坏，严重时可导致宿主的死亡；2)破坏器官的完整性，引起其他病原生物(如细菌、病毒等)的入侵，造成继发性感染，使机体产生病变；3)吸食宿主血液、粘液等，刺激宿主产生分泌物，致鳃呼吸受阻，影响正常的生理活动。近年来，海水鱼类的网箱养殖、滩涂养殖都有相当数量的病例出现(如哈氏本尼登虫高发于石斑鱼、鲷科等养殖鱼类，鰤本尼登虫常寄生于石斑鱼、鰤鱼、黄鱼等经济鱼类)，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。

在实际渔业生产的病害防控过程中，由于很难从外观上直接区分两种本尼登虫，目前仍缺乏行之有效的手段对其进行准确诊断，导致养殖病害防控失效的事例常有发生，造成经济损失。目前用于哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫有效且快速的判别方法还未见正式报道。因此寻找哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的可靠分子标记，从混杂的种质中鉴别区别两种本尼登虫成为一个亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对、试剂盒及鉴别方法，有助于解决两种本尼登虫病原生物体混杂问题，且鉴别方法操作简单，易于掌握，准确性高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的分子标记引物对，所述引物对包括CSF和CSR，所述CSF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CSR的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物对。

优选的，所述试剂盒中还包括：10×buffer、dNTPs和rTaq。

本发明还提供了上述引物对或上述试剂盒在鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫中的应用。

本发明还提供了一种鉴别哈氏本尼登虫和鰤本尼登虫的方法，包括以下步骤：提取受本尼登虫感染的鱼体表粘液内的基因组DNA作为模板，与上述引物对或上述试剂盒中的引物对混合进行PCR，对PCR产物测序，当测序结果具有如SEQ ID NO.3所示序列，则所述鱼感染哈氏本尼登虫；当测序结果具有如SEQ ID NO.4所示序列，则所述鱼感染鰤本尼登虫。

优选的，所述PCR的体系以22.5μl计，包括：10×buffer 2.5μl、dNTPs 2μl、rTaq0.5μl、模板1ng、引物各1μl和余量的ddH₂O。

优选的，所述PCR的程序包括：94℃预变性4min；94℃变性30sec，48℃退火40sec，72℃延伸50sec，40个循环；72℃延伸7min。