[发明专利]一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种同时扩增多个基因的引物组，其特征在于：所述引物组最少包括两组引物的核苷酸序列，所述的两组引物的核苷酸序列的分别如下所述：前引物为：5’-ctgggattacaggtgtgtcccaccatgcccagctaat-3’和后引物：5’-ggcctcccagagggctaggattataggtgt-3’，所述多个基因为eIF3A基因组。

2.一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的引物组，还包括Buffer PKD、蛋白酶K和Buffer RPE。

3.一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的检测方法，其特征在于：使用了权利要求2的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的检测方法，其特征在于：所述方法使用了PRC扩增，所述检测样品为刮取石蜡组织标本或者新鲜组织标本，包括以下步骤：

S1：将检测样品切片放入1.5ml离心管中，加1ml二甲苯，涡旋10秒，然后在20-25℃条件下，以132000rpm离心2分钟；

S2：吸弃上清液，往沉淀中加入1ml无水乙醇，涡旋混匀，132000rpm，20-25℃离心2分钟，再吸弃上清液，打开管盖，室温10分钟，使乙醇挥发干净；S3：加入150ul Buffer PKD，10ul蛋白酶K，重悬沉淀，涡旋混匀，分别55℃，15分钟；80℃，15分钟；

S4：加入320ul Buffer RBC，充分混匀，转移至含2ml收集管的gDNA结合柱，13000rpm,离心30秒，保留流出液；

S5：向流出液中加入720ul无水乙醇，反复吹打混匀，将700ul样品转移至含2ml收集管进行Rneasy MinElute spin colum，13000rpm，离心15秒，舍弃流出液，重复操作直至所有的样品gDNA结合柱；

S6：向RNA结合柱中加入500ul Buffer RPE，盖上管盖，13000rpm，离心15秒，洗膜，摒弃流出液；向RNA结合柱中加入500ul Buffer RPE，盖上管盖，13000rpm，离心2分钟，洗膜，弃流出液；将Rneasy MinElute spin colum放入干净的1.5ml收集管中，直接将20ul RNase-free水加至膜上，盖上管盖，13200rpm，离心1分钟，洗脱RNA；

S7：进行RNA的逆转录，11ul RNA模板，加1ul随机引物，混匀，将液体离心至管底，放入PCR仪，65℃，5分钟；

S8：基于S7，在实验过程中加液，依次加入：5xreaction buffer 4μL；RNase inhibitor(20u/ul)1μL；10mM dNTP Mix 2μL；M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/ul)1μL；Totalvolume per reaction 8μL，分成四组，分别为25℃,5分钟；42℃,60分钟；70℃，5分钟；4℃，5分钟；

S9：进行RNA的定量化，包括：将cDNA稀释10倍，取2ulcDNA稀释，加18ul ddH2O，配置Mix：ddH₂O 7μL，2x Quantitative Reaction Mix 10μL，RRM1/ACTB Forward and Reverseprimer 0.5μL+0.5ul，Total volume per reaction18ul，再将反应液加入PCR反应管进行检测。

5.权利要求4所述的一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的检测方法，其特征在于：所述反应液加入PCR反应管进行检测的步骤包括：PCR预变性程序和PCR扩增溶解反应程序，所述PCR预变性程序为95℃，5min；PCR扩增溶解反应程序为：95℃，10s，循环40次；60℃，15s，循环40次；72℃，20s，循环40次，再应用分析软件，给出CP(CT)值，根据计算公式得出基因的相对表达量E。