[发明专利]一种碱性蛋白酶突变体及其用途

说明书

本发明主要通过DNA改组技术，利用DNaseI消化地衣芽胞杆菌来源和克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因，纯化回收目的片段，通过无引物PCR和有引物PCR构建碱性蛋白酶突变库，筛选获得了一种碱性蛋白酶活力显著提高的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。适宜条件下，突变体碱性蛋白酶活力为61.75U/mL，相比野生型有显著提高。

技术领域

本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其用途。

背景技术

蛋白酶是一种具有复杂结构与功能的水解酶，能够裂解肽键产生短肽或氨基酸。按照最适pH值的不同，蛋白酶可分为三种类型：酸性蛋白酶，最适pH为2.0～5.0，主要来源于真菌；中性蛋白酶，最适pH为7.0，主要来源于植物；碱性蛋白酶，最适pH为8.0及以上，主要来源于微生物。蛋白酶作为最重要的工业酶制剂之一，销售额占所有酶制剂销售量的60％以上，在洗涤剂、医药、食品、皮革、丝绸、摄影等领域有着广泛的应用。

合成洗涤剂被用作清洁剂已有100多年的历史。目前，合成洗涤剂已经成为世界各地人们日常生活中不可或缺的一部分。然而，合成洗涤剂中的磷酸盐等成分对生态系统的负面影响逐渐得到了人们的重视。因此，作为洗涤剂中有害化学物质的环保型替代品，洗涤剂酶已迅速发展成为一个包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶在内的广阔领域。洗涤剂工业中通常使用的酶是碱性酶，因为洗涤剂的pH值通常在9.0到12.0之间。在洗涤剂使用的碱性酶中，碱性蛋白酶占据首位，占全球蛋白酶销量的40％。因此，开发一种高活力的碱性蛋白酶有助于降低洗涤剂蛋白酶成本并提高洗涤剂蛋白酶的生产效率。

定向进化，又称非理性设计，它不需要依赖于可靠的蛋白质结构和结构-功能关系等因素，而是在实验室中模拟自然进化机制，进而构建酶分子的体外进化条件，并定向筛选获得具有理想性能的突变体。DNA改组技术是定向进化技术的一种，该技术可以通过利用DNaseI将基因打断成一定的大小的片段,通过无引物PCR，使片段间发生错配，从而构建大型突变文库。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种碱性蛋白酶活力提高的碱性蛋白酶突变体。本发明主要通过DNA改组技术，利用DNaseI消化地衣芽胞杆菌来源和克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因，纯化回收目的片段，通过无引物PCR和有引物PCR构建碱性蛋白酶突变库，筛选获得了碱性蛋白酶活力显著提高的突变体。

本发明目的之一是，提供一种碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明目的之二是，提供编码所述碱性蛋白酶突变体的基因。

在本发明一种具体实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明目的之三是，提供包含所述碱性蛋白酶突变体的基因的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体。

在本发明一种具体实施方式中，所述载体是pWB980。

本发明目的之四是，提供包含所述编码基因或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是适合于从本发明的基因或载体生产本发明的碱性蛋白酶突变体的任何宿主，例如枯草芽孢杆菌。

在本发明一种具体实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽胞杆菌WB600。

本发明目的之五是，提供本发明所述碱性蛋白酶突变体的用途，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸；并且，所述碱性蛋白酶突变体相比野生型具有提高的碱性蛋白酶活力。