[发明专利]一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用

说明书

本发明涉及肿瘤耐药基因技术领域，特别涉及一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用，DUSP9的基因的序列为SEQ ID NO：1。其筛选方法包括以下步骤：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；筛选乐伐替尼耐药基因；有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。本发明通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因，为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据，为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点，为临床合理用药提供指导。

技术领域

本发明涉及肿瘤耐药基因技术领域，特别涉及一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用。

背景技术

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国所有中位居第三死亡率高居第二位死亡率高居第二位死亡率高居第二位。2018年9月4日乐伐替尼在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗，乐伐替尼正式取代索拉非尼成为国际上晚期肝癌一线治疗的首选药物，是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，主要作用于是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，乐伐替尼主要作用于是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，同时具有抗肿瘤细胞增殖及抗血管生成作用，靶向药物耐药的主要机制包括肿瘤建立代偿信号通路、靶蛋白改变、肿瘤微环境变化、肿瘤异质性产生和肿瘤对靶向药物的适应等，不同的分子靶向药物可能同时具有多种耐药机制，毫无疑问，分子靶向治疗为肿瘤患者提供了生存和预后获益，但耐药也是分子靶向药物面临的主要问题。目前对于乐伐替尼长期使用后产生的耐药性，尚未见报道，因此，积极探索乐伐替尼的耐药靶基因，对于减少乐伐替尼耐药，指导临床用药有着重要意义。

以往，药物耐药基因常用RNAi文库进行高通量筛选。但RNAi技术造成的表型变化不够稳定、明显，且细胞内源性的RNAi途径导致RNAi筛选存在着广泛的脱靶效应。CRISPR/Cas9 作为一种强大的基因组编辑工具，可以对基因进行完全敲除，为高通量筛选带来了革命性技术。在此基础上构建靶向全基因组范围的CRISPR/Cas9敲除文库，可实现全基因组范围的高通量筛选，能够快速产生功能缺失的突变体并且筛选所期望的表型，进而找出候选基因。与 RNAi技术相比，CRISPR/Cas9敲除文库具有相对较低的脱靶效率和更广泛的作用位点，因而逐渐成为功能性基因筛选的热点方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用。

一种乐伐替尼耐药基因DUSP9，该基因的序列为SEQ ID NO：1。

乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法为使用HuH7细胞株作为目的细胞，利用CRISPR-Cas9 的高通量功能性筛选技术进行乐伐替尼耐药的差异靶基因筛选，包括以下步骤：

步骤一：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；

步骤二：进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；

步骤三：稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；

步骤四：筛选乐伐替尼耐药基因；

步骤五：有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。

进一步地，预实验包括：细胞感染预实验、低MOI感染预实验-荧光、低MOI感染预实验-抗性、乐伐替尼药物浓度预实验。

具体地，细胞感染预实验包括：用包装好的GFP慢病毒感染目的细胞，观察不同MOI值下的感染效率，以确定sgRNA文库的最佳MOI；