[发明专利]基于基因沉默的褐飞虱防控基因Nach-like的dsRNA片段及其用途

说明书

本发明属于农业生物技术领域，涉及基于基因沉默的褐飞虱防控基因的dsRNA片段。本发明公开了一种褐飞虱Nach–like基因dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。本发明还同时公开了上述褐飞虱Nach–like基因dsRNA的用途：褐飞虱的Nach‑like基因dsRNA引发的基因沉默对褐飞虱存在致死效果。本发明还同时公开了上述褐飞虱Nach–like基因dsRNA的克隆方法和合成方法。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及基于基因沉默的褐飞虱防控基因的dsRNA片段。

背景技术

褐飞虱Nilaparvata lugens作为一种稻田重要害虫，在若虫期和成虫期均可危害水稻，每年对水稻产量带来巨大损失。其主要通过刺吸水稻韧皮部汁液的方式，导致水稻生长受到影响。同时刺吸的过程中也可以传播水稻病毒病，加重水稻病害的流行(程遐年等,2003)。目前对褐飞虱的防治主要依赖于化学农药防治，这种防治方式极易造成褐飞虱的抗药性，同时对生态环境带来严重污染(Cheng,2009)。因此，发展新的褐飞虱防治方法势在必行。

Zha等(2011)首次将褐飞虱的己糖转运蛋白基NlHT1、羧肽酶Nlcar和类丝氨酸蛋白酶Nltry等三个基因的dsRNA转入水稻植株中，获得了转褐飞虱靶标dsRNA的水稻，尽管褐飞虱取食这些水稻植株之后，仅相关基因的转录水平显著下降，并没有出现显著的致死表型，但是这种基于RNA干扰的转基因抗褐飞虱水稻的出现，为褐飞虱的防治提供了新的途径。随后，通过转入褐飞虱蜕皮激素受体基因ecr的dsRNA获得的新型转基因水稻，表现出对褐飞虱产卵量的抑制效果(Yu et al.,2014)。相继也有其他一些转褐飞虱其他靶标基因dsRNA的水稻的出现(陆琳等,2013；杨永义,2014)。尽管这些转基因水稻品系还不够成熟，但随着更多用于褐飞虱防治靶标基因的筛选，以及水稻中更高效的dsRNA表达方式的出现，基于RNA干扰的转基因水稻用于褐飞虱防治将会有更大的突破。

发明内容

本发明要解决的问题是提供了一个新的用于褐飞虱防控的基因dsRNA片段，将为基于RNAi的转基因抗褐飞虱水稻的研发提供基因资源。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种褐飞虱Nach–like基因dsRNA(片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

本发明还同时提供了上述褐飞虱Nach–like基因dsRNA的用途：褐飞虱的Nach-like基因dsRNA引发的基因沉默对褐飞虱存在致死效果。

本发明还同时提供了上述褐飞虱Nach–like基因dsRNA的克隆方法，包括如下步骤：

(1)NCBI数据库中获得褐飞虱Nach-like序列，其序列ID为XM_022348347.1；利用Primer5软件(Primer5软件)设计引物，得到正向引物、反向引物；以反转录得到的cDNA作为模板，通过PCR扩增得到目标产物片段；

正向引物：AGTAAGAATCCAGCCTCAGT

反向引物：AGCAAGGAACAACCAGTAGA；

(2)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目的条带切割回收纯化；

(3)回收纯化后将产物连接在pCE2-TA/Blunt-Zero载体上，转入DH5α感受态细胞中，涂于具有Amp抗性的筛选培养基上，挑取阳性单菌落于具有Amp抗性的液体LB培养基中，进行测序；

(4)将测序结果通过NCBI数据库进行Blast，得到褐飞虱Nach-like基因的序列片段SEQ ID NO.1，即，得到含有褐飞虱Nach–like基因dsRNA目的序列(SEQ ID NO.1)的质粒。

本发明还同时提供了上述褐飞虱Nach–like基因dsRNA的合成方法，包括如下步骤：