[发明专利]一种解脲支原体感染的诊断标物及其对应的检测试剂盒的制备方法与应用

权利要求书

1.一种解脲支原体感染的诊断标物，其特征在于，所述的诊断标物为含有UUR10_0579蛋白抗原决定簇位点的多肽，其氨基酸序列如序列1所示。

2.根据权利要求1所述的解脲支原体感染的诊断标物制备检测试剂盒的方法，包括以下步骤：

S1采用实验生物信息学软件分析UUR10_0579蛋白的氨基酸序列，预测并确定该UUR10_0579蛋白上的抗原决定簇位点，通过人工合包含该抗原决定簇位点的多肽，多肽的氨基酸序列如序列1所示；

S2将步骤S1中人工合成出来的多肽作为抗原，用包被缓冲液进行稀释，得到稀释多肽液，以100μL/孔将稀释多肽液加入96孔酶标板中，4℃过夜洗板3次，然后向其中加入200μL含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育1h后，洗板3次，凉干，用密封袋封装，得到预先包被UUR10_0579蛋白抗原的酶标板，保存备用；

S3 ELISA检测试剂盒的成分：⑴步骤S2中的预先包被UUR10_0579蛋白抗原的酶标板；⑵小牛血清3mL x 1瓶；⑶酶标抗体3.2mL x 1瓶；⑷阳性对照血清1mL x 1瓶；⑸阴性对照血清1mL x 1瓶；⑹浓缩洗涤液30mL x 1瓶；⑺显色剂A4mL x 1瓶；⑻显色剂B 4mL x 1瓶；⑼终止剂3.5mL x 1瓶；⑽封板片3片；⑾血清标本稀释缓冲液1瓶。

3.根据权利要求2所述的解脲支原体感染的诊断标物制备检测试剂盒的方法.其特征在于，所述步骤S2中，包被缓冲液为0.05摩尔/升碳酸盐缓冲液，pH 9.6，具体制备过程是将1.59克碳酸钠和2.93克碳酸氢钠溶解于1000毫升蒸馏水中，溶解混匀；包被缓冲液将多肽稀释至10μg/mL。

4.根据权利要求2所述的解脲支原体感染的诊断标物制备检测试剂盒的方法.其特征在于，所述步骤S2中，磷酸盐缓冲液为0.01摩尔/升PBS，pH 7.4，具体制备过程是将8.0克氯化钠，0.2克磷酸二氢钾，2.9克磷酸氢二钠和0.2克氯化钾加入1000毫升蒸馏水，溶解混匀；封闭液：100毫升PBS中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。

5.根据权利要求2所述的解脲支原体感染的诊断标物制备检测试剂盒的方法.其特征在于，所述步骤S3中，酶标抗体为酶标二抗，具体为商品化的HRP(辣根过氧化物酶)标记的马抗鼠IgG；浓缩洗涤液为p H值＝7.4并且终浓度为0.1mol/L的PBS溶液中加入Tween-20，使得Tween-20的浓度为0.5％(v/v)，使用前用水稀释10倍；按30mL/瓶分装；显色剂A是将醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml，按4mL/瓶分装；显色剂B是将乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50ml,0.15g TMB蒸馏水加至500ml，按4mL/瓶分装；终止剂为2mol/L H₂SO₄；血清标本稀释缓冲液为pH7.2-7.5的磷酸缓冲液。

6.根据权利要求2～5中任意一项所述的检测试剂盒检测UUR10_0579蛋白血清中特异性抗体的方法，包括以下步骤：

(1)加样：取待检血清，加入血清标本稀释缓冲液，混匀；

(2)孵育：孔中加入小牛血清和待检血清标本各一滴，设阴/阳性对照各两孔，每孔加入阴性对照或阳性对照各两滴，在37℃下封板1h；

(3)洗涤：微孔板甩去孔内液体，注入洗涤液，放10秒钟，甩干，并重复4次；

(4)加入酶标抗体：每孔加酶标记的抗体1滴，在37℃下封板1h；

(5)洗板同前；

(6)显色：加显色剂A与显色剂B各一滴，在37℃下静置20min；

(7)终止反应：每孔加终止剂1滴；

(9)观察记录结果：读取490nm处激发光时的OD光密度值，计算抗体含量。